细胞培养肉作为新兴肉类生产技术，被认为是应对传统畜牧业资源消耗、环境污染和全球肉类需求增长的重要策略。通过体外培养肌肉细胞，可突破传统养殖在周期、空间和动物福利方面的限制，实现肉类高效可控生产。三维多孔支架在细胞培养肉生产中扮演着关键角色，为细胞提供附着、迁移、增殖和分化的物理支撑，并模拟天然肌肉组织的细胞外基质微环境。理想的细胞培养肉支架应具备良好的生物相容性、可食用性、较低的降解性以及适宜的多孔结构。三维多孔支架需满足细胞生长所需的环境和适宜的孔径大小。气泡模板法是一种通过调控气泡动态形成孔隙结构的多孔支架制备方法，可有效克服传统支架孔径过小或分布不均的缺陷，为营养物质传输和细胞迁移提供更优通道，形成更适合细胞生长的微环境。
玉米醇溶蛋白（Zein）、高粱醇溶蛋白、小麦谷蛋白、胶原蛋白、明胶等天然高分子材料作为细胞培养肉支架已被广泛研究。研究证实，以高粱为原料制备的醇溶蛋白构建的多孔支架能有效支持细胞黏附与增殖。白酒酒糟醇溶蛋白（PBJ）是酒糟中的主要蛋白组分，原料来源广泛。团队前期研究发现，PBJ具备良好的发泡性和两亲性，在生物材料领域展现出应用潜力。团队前期通过碱醇法提取白酒酒糟（BJ）中的醇溶蛋白，鉴定主要蛋白组分来源于高粱，醇溶蛋白占比达到54%～78%，这为PBJ在细胞培养肉支架中的应用提供了理论依据。PBJ作为食品加工副产物，在成本控制与可持续性方面具有天然优势。然而，PBJ在细胞培养肉支架中应用效果尚不清楚。
研究发现，单一蛋白质作为细胞支架仍面临结构稳定性差、成本高等局限。蛋白质-多糖复合被认为是改善材料性能的有效途径。结冷胶（GG）作为一种微生物多糖，广泛应用于食品和生物医学领域，其与蛋白复合可通过氢键、静电作用等分子间相互作用形成稳定的复合凝胶体系，可为制备结构稳定的支架提供良好的基础。
基于此，河北农业大学食品科技学院的薛思瑶、王凤忠*，中国农业科学院农产品加工研究所的刘丽娅*等以PBJ为主要原料构建细胞培养肉支架，PBJ来源广泛、价格低廉，旨在实现食品加工副产物的高值化利用，拓展细胞培养肉支架的原料来源；采用气泡模板法结合蛋白质-多糖复合策略调控GG添加量，旨在克服传统蛋白支架孔径不均、连通性差的局限；探究PBJ在无需化学交联剂条件下的溶胀性能、结构稳定性和生物相容性等，旨在保证原料易得性、可持续性的同时简化制备工艺。
1 流变行为分析
如图1A所示，所有凝胶均表现为弹性主导（G’＞G”）。其中，PBJ-G1的G’最低，随着GG质量浓度的增加，G’逐渐上升，当GG质量浓度从1 mg/mL增加到3 mg/mL 再到5 mg/mL时，样品的G’最大值从7.62 Pa增加到73 Pa再到120 Pa，这说明多糖含量对热诱导网络的稳固性起关键作用。具体而言，4～5 mg/mL GG所形成的凝胶具有更宽的LVR和更高的屈服应力，结构更为稳定。相反，低质量浓度凝胶（如1 mg/mL GG）的LVR范围窄，结构脆弱，稳定性较差。
如图1B所示，所有样品的G’均随频率增加而上升，且始终显著高于G”，进一步验证了凝胶的结构稳定性。尽管G”的绝对值随GG质量浓度增加略有升高，但所有体系中仍然是G’＞G”，表现出典型的类固体行为。
如图1C所示，升温阶段（25 ℃→85 ℃）时，样品PBJ-G2、PBJ-G3、PBJ-G4、PBJ-G5的G’先保持较高水平，随后急剧下降；而PBJ-G1的G’始终较低，且下降更早、更显著，这可能是因为GG添加量不足，导致凝胶强度低，因此，G’的值始终较低。在温度接近85 ℃时，PBJ-G1曲线呈现上下波动，证明PBJ-G1在高温时凝胶结构表现不稳定；然而，随着GG的添加，PBJ-G2、PBJ-G3、PBJ-G4、PBJ-G5在高温时仍表现稳定。在随后的降温阶段（85 ℃→25 ℃），所有凝胶样品的G’随温度下降恢复至初始值，证明样品的凝胶强度在经过高温冷却后仍能恢复，具备热可逆凝胶的特性，这一现象可能与GG的热可逆性质有关。在整个温度变化过程中，G’始终远大于G”，验证凝胶始终以弹性行为为主导，证实PBJ与GG形成了弹性凝胶网络。
2 支架微观结构分析
在细胞培养应用中，支架的三维多孔结构对细胞迁移、营养物质输送及代谢物排出具有关键影响。本研究通过扫描电子显微镜系统评估了由PBJ与GG构建的PBJ-GG支架的微观形貌。如图2所示，PBJ经高速分散发泡并冻干后，呈现分散的颗粒状，缺乏相互连通的孔隙网络。这可能是PBJ本身黏度较低、气泡在发泡过程中的聚并受限，孔隙不连续所致。GG在水相中表现出高黏度和快速凝胶化的特性，能够在发泡瞬间捕获气泡并抑制合并。添加GG后，支架呈现出了微纳分级的多孔结构。如图3所示，随着GG的增加，支架孔径分布趋于均一，孔形更加规则，孔壁增厚且连续性提高，结构稳定性得到显著增强，这可能是因为多糖的添加使支架整体结构更稳定，孔隙结构更均匀，这与前人研究 一致。当GG添加量为1 mg/mL时，支架的平均孔径为308 μm，孔壁薄，结构不稳定，容易破碎。随着GG增加至2～5 mg/mL，支架平均孔径减小，PBJ-G2、PBJ-G3、PBJ-G4、PBJ-G5的支架平均孔径分布于230～247 μm，这表明凝胶强度与黏度的提升有效抑制了气泡的聚并和熟化，从而形成更为均一稳定的多孔构造。有研究表明，当支架孔径介于200～300 μm时，被认为适合成肌细胞的生长以及营养物质的渗透，GG添加量为2～5 mg/mL的支架，拥有合适的孔隙结构（230～247 μm），具备作为细胞培养肉支架的潜力。同时，在支架孔隙结构的均匀性与完整性上，PBJ-G2、PBJ-G3与PBJ-G4表现更为突出。与Su Lingshan等研究的关于醇溶蛋白和Chen Yan等制备的以明胶为原料的细胞培养肉支架相比，本研究以PBJ为原料制备出孔隙贯通均匀的细胞培养肉支架，无需化学交联剂，降低原料成本的同时拓宽了PBJ高值化利用路径。
3 溶胀率分析
构建结构化的细胞培养肉模型，要求支架材料具备多孔微观结构，有利于细胞渗透的吸水能力，以及在长期培养过程中为种子细胞提供稳定的机械支撑，高溶胀性支架可以快速吸收培养基，改善细胞的黏附和增殖，有利于其在细胞培养肉中的应用。图4显示在初始阶段（1～12 h）支架溶胀速率最快，随后逐渐减缓，并于24～48 h内达到溶胀平衡。当GG质量浓度为1 mg/mL时，支架在1 h内吸收速率最高，在12 h基本达到平衡，最终溶胀率达到3 052%；GG质量浓度增加到2 mg/mL时，支架在24 h后各时间点表现出较高的溶胀水平。最后除PBJ-G1外，所有支架在48 h时溶胀率水平达到4 151.5%～4 309.5%，均在4 000%以上，该溶胀水平显著优于Xia Ping等研究的大豆蛋白细胞培养肉支架的溶胀水平（2 000%～2 500%），这可能归因于该组支架在前期研究中展现出的高孔隙率与理想的多孔网络结构，该结构为水分的毛细管渗透与快速扩散提供了有效通道。GG与PBJ形成的复合网络，赋予支架优异的吸水与持水性能。整体而言，如图5所示，所有支架均表现出较高的溶胀水平，本研究通过调控GG添加量，以及气泡模板法的引入，成功构建了多孔结构，该结构显著增强了支架持水能力与液体扩散效率。
4 傅里叶变换红外光谱分析
图6展示了PBJ、GG及PBJ-GG支架的红外光谱。单一PBJ样品在3 320 cm-1附近有一个宽而强的吸收峰，这归属于蛋白质分子中O—H和N—H键的伸缩振动。1 039 cm-1处的吸收峰对应的是多糖特征区，这个C—O键的吸收峰是多糖骨架的典型标志，它的存在证明GG在支架网络中得到了保留。1 656 cm-1和1 538 cm-1处的吸收峰分别对应蛋白质的酰胺I带（C＝O伸缩振动）和酰胺II带（N—H弯曲振动与C—N 伸缩振动的耦合），它们在复合支架中的轻微位移与峰形变化，表明PBJ诱导蛋白质二级结构发生一定程度的变化，说明PBJ与GG间相互作用的存在。
5 降解率分析
降解率反映支架在培养周期内保持结构完整性与机械支撑的能力，培养14 d的细胞培养肉支架能够维持细胞活性并实现肌肉分化。因此在此期间支架能否保留其大部分成分并维持其原有形状至关重要。本研究测定了支架培养两周的降解情况，结果如图7所示。在14 d时，PBJ-G1的降解率最高，为33.33%，这可能是因为蛋白质（PBJ）占主导，网络中氢键较少，孔隙较大，水分渗透快，水解速率高。随着GG含量的增加，支架降解率有所降低，这可能是因为蛋白质-多糖的互作导致氢键的增加有利于维持支架形态结构。总体而言，所有支架在14 d内均能保持完整形态，具备作为细胞培养支架的潜力。
6 贮存稳定性分析
贮存稳定性是支架在整个细胞培养过程中保持其结构完整性和机械支持的可靠指标。如图8所示，各组支架在1～14 d内无明显变化，均能保持完整形貌，然而最高质量浓度的支架PBJ-G5先出现沉底，随后PBJ-G3和PBJ-G4也相继沉底，这种现象可能与支架内部结构的致密化程度及其物理密度变化有关。随着GG质量浓度的增加，支架内部结构更加致密，支架内部的交联网络会变得更加紧密，固体物质含量增加导致支架整体密度增大，当支架密度超过PBS密度时，会发生沉降。值得注意的是，在42 d的观察期内，所有支架没有明显的扩散溶解，没有出现絮状降解物，说明PBJ-GG支架水稳定性表现良好，在水相环境中具有优良的稳定性。结果表明PBJ-GG复合支架能长期在水环境内保持结构稳定。
7 细胞毒性评估
对PBJ的细胞毒性采用CCK-8法进行评估，结果如图9所示。数据显示，PBJ处理组的细胞活力维持在99%～104%之间，根据ISO 10993-5:2009国际标准，细胞活力值高于75%可被认为是无细胞毒性。因此说明该蛋白在所用质量浓度范围无细胞毒性，不抑制细胞代谢，甚至略有促进作用，具备作为细胞培养支架材料的潜力。同时，相关研究表明，GG作为公认安全的食品添加剂，在31.25～1 000 μg/mL的质量浓度范围区间内，细胞活力为92%～118%，同样远高于阈值，表明其对细胞无显著毒性。结冷胶是被 GB 2760—2024《食品添加剂使用标准》明确认可的食品添加剂，功能是增稠剂。在大多数食品中，它都可以按生产需要适量使用。
因此本研究制备的多孔支架材料无细胞毒性，良好的生物相容性可能来源于天然蛋白（PBJ）本身的低毒性和食品级多糖（GG）在安全浓度范围内的无毒性，并且由氢键强化的稳定结构以及二者的协同作用，共同保障了支架良好的细胞相容性。
8 细胞相容性与增殖评估
三维支架在细胞培养肉中起到关键作用，它不仅为细胞提供机械支撑，促进细胞培养，还能模拟肉的质地，满足高度结构化细胞培养肉产品的要求。如图10所示，在增殖培养初期，C2C12细胞在支架上呈球状并零星分布，细胞之间的相互接触有限。随着培养时间延长，细胞数量逐渐增多，形态由圆形转为纺锤形。培养至第4天，可观察到明显的细胞增殖现象，细胞数量呈指数增长，这与Xia Ping等研究结果一致；到第7天，支架表面几乎被增殖的C2C12细胞覆盖，荧光活细胞染色（Calcein-AM/PI）显示活细胞占比超过90%。上述结果表明多孔支架结构为C2C12细胞提供了良好的生长环境。
为定量评估支架对细胞增殖的影响，研究进一步检测了支架在培养1、4 d和7 d后的细胞数量变化，以不含PBJ和GG支架的完全培养基作为对照组。如图11所示，基于PBJ与GG构建的多孔支架上，C2C12细胞数量在各时间点均呈现显著增长趋势。与对照组相比，细胞数量未出现显著降低。细胞数量从初始的约200 个/mm2增加到约1 280 个/mm2。在培养第7天时，所有支架上的细胞数量均可达到初始接种量的5 倍以上。这一优异表现可能归因于PBJ-GG支架所提供的相对适宜的孔径大小和细胞生长微环境，从而更有利于细胞的早期黏附和后续增殖。该定量结果与荧光显微镜的观察结果相互印证，共同表明由PBJ和GG组成的支架具有优异的生物相容性以及促进C2C12细胞增殖能力。
本研究初步证实了PBJ-GG支架作为细胞培养肉载体材料的可行性。然而，要实现功能性肌肉组织的体外构建，后续在特定诱导培养基下进行的成肌分化实验，以及相关标志物的检测将是不可或缺的关键步骤。这将是本团队未来研究的重点方向。
结 论
本研究以PBJ和GG为原料，基于气泡模板法制备了PBJ-GG复合多孔支架，证实GG是调控PBJ-GG复合支架性能的关键因素，评估了支架对C2C12细胞相容性的影响。添加2～5 mg/mL GG可显著增强PBJ-GG复合凝胶的G’和结构稳定性，形成孔径均一（230～247 μm）、孔壁完整且相互贯通的三维网络。CCK-8法与生物相容性评估均证实，所有PBJ-GG支架均无细胞毒性。
本研究制备的PBJ-GG支架孔径与文献报道的大豆蛋白、高粱醇溶蛋白制备的细胞培养肉支架孔径尺寸相近（100～300 μm），处于适宜细胞生长的范围；相较于需要复杂交联剂的蛋白支架，PBJ来源广泛、价格低廉，PBJ-GG仅通过物理发泡与多糖复配即展现出优异的溶胀性能（＞4 000%）和结构稳定性。同时，气泡模板法简易可控，可获得理想的支架孔隙均匀度与贯通性，利于营养物质渗透以及细胞生长。本研究为细胞培养肉产业化发展提供新的支架材料，为食品加工副产物白酒酒糟高值化利用开辟新路径。
引文格式：
薛思瑶, 陈兆诗, 米思, 等. 基于气泡模板法制备白酒酒糟醇溶蛋白-结冷胶多孔细胞培养肉支架[J]. 食品科学, 2026, 47(11): 49-57. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251219-163 .
XUE Siyao, CHEN Zhaoshi, MI Si, et al. Preparation of porous cell-cultured meat scaffolds from Baijiu Jiuzao prolamin and gellan gum using bubble template method[J]. Food Science, 2026, 47(11): 49-57. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251219-163.
实习编辑：彤禾；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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