Cell Stem Cell | 共培养“构建”内皮化骨痂类器官，加速软骨内成骨|内皮|成骨|祖细胞|血管化

撰文 | 格格

长骨缺损达到一定尺寸（临界尺寸）无法自发愈合，现有疗法均存在明显局限：自体骨移植受限于供区来源和再生能力，异体移植和牵张成骨面临免疫排斥、感染及疗程长等问题，而BMP-2的安全性争议也限制了其临床应用【1，2】。因此，亟需开发有效的组织工程策略。骨折愈合依赖于软骨内成骨过程——骨膜祖细胞形成软骨性骨痂，再经血管化、矿化和重塑转为成熟骨【3，4】，其中内皮细胞与祖细胞的相互作用至关重要。当前基于多种成体干细胞构建的软骨微组织/类器官虽能部分修复骨缺损，但修复临界尺寸的长骨节段性缺损时仍难以实现完全再生，核心瓶颈在于大体积缺损中功能性血管网络的构建仍是一大难题，现有体系在自组装结构、体内血管化效率及宿主整合方面均远不能满足临床需求。

近日，来自比利时鲁汶大学（KU Leuven）发育与再生系骨骼生物学与工程研究中心的Ioannis Papantoniou研究团队在Cell Stem Cell杂志发表题为Endothelialized callus organoids driverapid regeneration of critical-sizesegmental long bone defects的研究论文，该研究旨在通过共培养人骨膜来源的骨骼祖细胞与内皮细胞，构建一种能模拟骨折骨痂细胞复杂性的内皮化骨痂类器官（hECO），以解决临界尺寸长骨缺损难以再生修复的临床难题，并发现该hECO在体外分化后形成的宏尺度聚集体可作为瞬时生物模板，在体内快速促进宿主血管化和软骨内成骨，成功实现免疫缺陷小鼠临界尺寸胫骨缺损的完全再生。

首先，研究人员为了探究内皮细胞（EC）类型和比例对类器官形成的影响，将人骨膜来源细胞（hPDC）与25%或50%的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）或人微血管内皮细胞（MVEC）共培养，构建了四种内皮化骨痂类器官（hECO），并以纯hPDC类器官（hCO）为对照。结果显示，EC的加入增强了软骨分化，细胞外基质更致密，且EC在类器官核心自组装成血管样网络。增殖实验表明，EC共培养显著增加了Ki67 + 增殖细胞数量，但增殖仅发生在hPDC而非EC中，同时EC在早期经历时间依赖性凋亡，至第7天比例下降。重要的是，hECO中COL10A1和IHH显著上调而SP7下调，表明EC将分化轨迹从直接成骨转向加速的软骨内成骨方向。

进一步，通过单核RNA测序（snRNA-seq）和空间转录组学，研究人员鉴定了类器官内多个软骨细胞亚群，包括软骨祖细胞、效应软骨细胞、前肥大/肥大软骨细胞及多种调控性软骨细胞，并构建了从祖细胞经调控态向终末分化细胞的分化轨迹。组成分析显示，hECO在第7天即含有更高比例的效应软骨细胞，其细胞组成与第14天的hCO相似，证实EC加速了发育进程。将类器官转录组映射到胎儿骨膜、生长板和骨折骨痂的骨骼祖细胞参考数据集后，发现M50类器官的细胞分布最接近体内参考组织。细胞间通讯分析进一步揭示了EC、肥大软骨细胞和调控性软骨细胞通过PERIOSTIN-SPP1、THBS、NOTCH、PDGF、BMP和FGF六条关键信号轴协调类器官发育的层级调控网络。

接下来，研究人员将未成熟（6天）或成熟（13天）的类器官自组装成宏尺度聚集体，并异位植入免疫缺陷小鼠皮下评估成骨能力。4周后，7天分化的hECO聚集体形成矿化组织，而hCO仅形成纤维组织，且更高EC含量（H50和M50）促进致密骨和早期骨髓区域形成。14天分化的hECO聚集体中，即使是低EC含量组也能促进矿化，而H50和M50组则形成包含皮质骨、松质骨和大型骨髓腔的成熟骨化结构。血管化分析显示，H50和M50组的血管数量较对照组增加约5~8倍，且供体来源的血管在4周时完全被宿主血管替代，表明hECO作为瞬时模板引导宿主血管入侵和骨组织重塑。

研究人员进一步将hECO聚集体植入免疫缺陷小鼠5mm临界尺寸胫骨缺损模型中评估原位再生能力。8周后，对照组持续不愈合，残留缺损达2.7mm；H50组仅部分愈合，残留缺损1.7mm且骨断端间散在多个微小骨岛；而M50组在4周时4只中有3只实现完全桥接，至8周时全部实现皮质骨连续性和骨髓腔结构恢复。组织学分析显示对照组纤维/软骨组织占比大，而M50组接近天然骨结构。免疫染色证实供体细胞在2周时参与修复（约占30%~46%），至8周时降至<4%，且供体来源EC仅在2周时形成团簇状结构而不形成功能性血管，进一步证实hECO作为瞬时模板引导宿主自身再生的作用机制。

最后，蛋白组和分泌组分析从分子层面验证了上述表型。M50类器官在第14天表现出最显著的差异蛋白表达和ECM重塑特征，包括基底膜胶原（COL4A1/2）、基质蛋白（MATN3）及生物矿化相关蛋白（SPP1、PHOSPHO1）的上调，同时分泌组富集了LOX、CHAD和CLEC3A等参与ECM交联和矿化的蛋白。而对照组则保留较高水平的纤维化胶原COL3A1。STRING网络分析显示M50具有最高的相互作用密度和协调的ECM成熟网络，这些分子特征共同解释了M50类器官在体内加速软骨内成骨、血管化和骨再生的优越性能。

图一共培养“构建”内皮化骨痂类器官，加速软骨内成骨

总之，该研究发现内皮化骨痂类器官可作为瞬时生物模板快速引导宿主血管化和软骨内成骨，实现临界尺寸骨缺损的完全再生，为无外源支架的“现成可用”骨再生策略提供了新思路。

https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(26)00306-1

制版人：十一

参考文献

1. De Pace, R., Molinari, S., Mazzoni, E., and Perale, G. (2025). Bone Regeneration: A Review of Current Treatment Strategies.J. Clin. Med.14, 1838.

2. Adejuyigbe, B., Gharpure, M., Wahle, C.F., and Kallini, J.R. (2024). Distraction Osteogenesis: A Comprehensive Review.Appl. Biosci.3, 503–516.

3. Einhorn, T.A., and Gerstenfeld, L.C. (2015). Fracture healing: mechanisms and interventions.Nat. Rev. Rheumatol.11, 45–54.

4. Lenas, P., Moos, M., and Luyten, F.P. (2009). Developmental engineering: a new paradigm for the design and manufacturing of cell-based products. Part I: from three-dimensional cell growth to biomimetics of in vivo development.Tissue Eng. Part B Rev.15, 381–394.

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（*排名不分先后）