椰毒假单胞菌酵米面亚种（Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans）可产生多种毒素，其中毒黄素（TXF）是其引发食物中毒与器官损伤的重要毒性代谢产物之一。该毒素分子式为C7H7N5O2，是一种水溶性三嗪类小分子毒素，可作用于呼吸链致人中毒，对人体肝、肾等器官有显著毒性。尽管毒黄素的化学结构及部分毒理学效应已被初步阐明，但其诱导细胞毒性的深层分子机制，尤其是关键作用靶点与相关信号通路的系统性解析尚不清晰，这在一定程度上制约了对其针对性防控策略及治疗靶点的研发。
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是调节多种细胞过程的关键通路，其通过核心成员c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38蛋白激酶和细胞外调节蛋白激酶（ERK）调控细胞增殖、凋亡、分化及应激等多种生理病理过程。其中JNK与p38作为应激激活型激酶，被视为研究外源性毒物作用机制的重要分子靶点。近年来，网络药理学为系统性预测药物或毒素作用靶点及通路提供了高效的研究策略。
深圳市计量质量检测研究院的陈晶、刘斌、刘新元*等综合利用网络药理学与体外细胞实验，系统探讨毒黄素诱导细胞毒性的分子机制。通过网络药理学方法预测毒黄素与细胞毒性的共同作用靶点，并进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析；进一步结合细胞实验验证毒黄素对肝、肾细胞活性与凋亡的影响，并探究毒黄素是否通过调控MAPK通路发挥毒性作用，旨在为阐明毒黄素的毒性机制提供新的实验依据，为相关食品中毒事件的科学防控及潜在治疗靶点筛选提供理论支撑。
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毒黄素细胞毒性潜在靶点的获取
由图1可知，通过SwissTargetPrediction平台和Similarity ensemble approach在线平台对毒黄素的潜在作用靶点进行预测，在剔除重复值后共获得119 个靶点。同时，从GeneCards数据库中提取与细胞毒性（涵盖细胞凋亡与增殖调控）相关的靶点384 个。进一步借助Venny 2.1.0工具对上述两组靶点集进行交集分析，最终获得28 个共有靶点，作为毒黄素介导细胞毒性的关键候选靶点。
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毒黄素细胞毒性的PPI网络图以及关键靶点的筛选
将获得的28 个毒黄素细胞毒性潜在靶点导入STRING数据库，构建PPI网络（图2A）。利用Cytoscape 3.7.2软件对该网络进行拓扑分析，绘制“毒黄素-潜在靶点”互作网络图（图2B），并基于节点度值指标对靶点进行重要性排序（表1）。结果显示，MAPK8（JNK1）作为JNK家族核心亚型，在所有潜在靶点中具有最高节点度值（55.74），表明其在PPI网络中处于核心节点地位，提示JNK可能在毒黄素诱导的细胞毒性过程中发挥核心调控作用。
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KEGG富集分析结果
由图3可知，毒黄素的细胞毒性与多条核心信号转导通路密切相关。其中磷酸肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信号通路（PI3K-Akt）和禽类成红细胞白血病病毒v-erb-B癌基因同源物（ErbB）信号通路的-lg P较高，提示其富集显著性较强。ErbB信号通路的富集因子最高，表明该通路中富集靶点的占比最大。除此之外，MAPK信号通路亦被显著富集。值得注意的是，在PPI网络中处于核心地位的靶点JNK1是MAPK信号通路的关键蛋白。这一结果进一步提示，MAPK信号通路是毒黄素发挥细胞毒性效应的核心通路，其具体机制可能涉及JNK蛋白的激活。
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毒黄素抑制LX2和293T细胞活力与增殖
采用CCK-8实验检测毒黄素对LX2及293T细胞活力和增殖的影响（图4）。如图4A、B所示，毒黄素浓度为0～0.156 μmol/L时，对LX2和293T细胞活力影响微弱；随着毒黄素作用浓度在0.156～10 μmol/L范围升高，LX2和293T细胞活力持续降低直至失活。通过GraphPad Prism软件进行量效关系曲线拟合，得到毒黄素对LX2细胞的IC50为0.734 μmol/L，对293T细胞的IC50为0.959 μmol/L。进一步绘制细胞增殖曲线，如图4C、D所示，与对照组相比，毒黄素处理组的LX2细胞和293T细胞增殖速率均显著减缓，培养后期细胞密度差异尤为明显。以上结果表明，毒黄素能够有效抑制LX2和293T细胞活力及增殖。
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毒黄素诱导LX2和293T细胞凋亡
流式细胞术检测LX2与293T细胞的凋亡情况。由图5A、B可知，与对照组相比，毒黄素处理可显著提高两种细胞凋亡比例，且该效应呈现浓度依赖性，表现为两种细胞早期细胞凋亡率与晚期细胞凋亡率随着毒黄素处理浓度的升高而逐渐增加。
通过WB实验检测细胞凋亡相关蛋白的表达水平变化。由图5C、D可知，与对照组相比，经毒黄素处理后，LX2细胞和293T细胞中Bim与Bak的表达量均高度显著上调。同时，细胞凋亡执行阶段的核心标志物c-caspase 3蛋白表达水平也高度显著上调（P＜0.001）。综上，毒黄素能够以浓度依赖方式诱导LX2及293T细胞发生凋亡，其机制可能与上调促凋亡蛋白Bim、Bak及激活c-caspase 3通路有关。
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毒黄素对LX2和293T细胞中JNK/p38蛋白磷酸化水平的影响
进一步解析毒黄素诱导细胞毒性的潜在信号传导机制，基于网络药理学分析结果，综合考虑通路富集显著性、靶点核心性及生物学功能关联性，选取MAPK信号通路作为关键候选通路进行验证实验。通过WB实验检测MAPK信号通路中关键蛋白JNK、p38和ERK的磷酸化水平，由图6可知，与对照组相比，毒黄素处理后的LX2细胞和293T细胞中JNK和p38蛋白的磷酸化水平明显升高，而ERK蛋白磷酸化水平变化不显著，说明毒黄素可激活LX2和293T细胞中MAPK信号通路JNK/p38分支，介导下游相关信号转导。
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毒黄素与JNK/p38蛋白分子对接模拟分析
为深入探究毒黄素与JNK/p38蛋白的相互作用机制，进行分子对接模拟分析。由图7可知，毒黄素与JNK、p38蛋白的结合能分别为-20.25 kJ/mol和-21.46 kJ/mol， 提示二者可形成热力学稳定的复合物。相互作用分析表明，毒黄素可与JNK蛋白的关键残基第304位异亮氨酸（Ile304）形成氢键，并与p38蛋白的第243位甘氨酸（Gly243）、第246位亮氨酸（Leu246）及第292位天冬氨酸（Asp292）等关键残基构成氢键相互作用网络。上述分子对接模拟结果从蛋白结构层面说明毒黄素可直接结合JNK/p38蛋白，为阐释毒黄素激活该信号通路的分子机制提供了理论依据。
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本研究综合运用网络药理学与细胞实验，系统探讨了毒黄素诱导细胞毒性的机制。通过靶点预测和PPI网络分析，获得28 个毒黄素与细胞毒性的共同作用靶点，其中MAPK8（JNK1）的相关度值最高，说明JNK蛋白在毒黄素细胞毒性分子调控中可能发挥关键作用。KEGG富集分析结果显示，28 个潜在靶点显著富集于PI3K-AKT、ErbB、Ras及MAPK等经典信号通路，这些通路均与细胞增殖、凋亡等功能密切相关。其中，MAPK通路是调控细胞应激反应、增殖及凋亡的核心信号轴，可激活下游转录因子AP-1、ATF-2，进而调控Bim、Bak等促凋亡蛋白表达，启动caspase级联反应，最终诱导细胞凋亡。JNK蛋白作为MAPK通路的关键分子在本研究中被识别为核心靶点，为机制验证提供了重要线索。需注意的是，尽管本研究通过双平台进行靶点预测，并设定筛选条件尽量降低预测偏差，但网络药理学受算法结构匹配、数据库注释差异等局限，仍可能产生假阳性与假阴性结果，造成靶点误判或遗漏，干扰实验结论。因此，本研究通过体外细胞实验和分子对接对靶点进行验证。
体外细胞实验显示，毒黄素对LX2和293T细胞的细胞活力均具有浓度依赖性抑制效应，并显著抑制两种细胞的增殖能力。同时毒黄素显著上调细胞中促凋亡相关蛋白Bim、Bak及c-caspase 3表达，诱导细胞凋亡，这表明毒黄素可通过抑制增殖和促进凋亡2 条途径发挥其对肝、肾来源细胞的毒性效应。为进一步阐明其上游分子机制，本研究基于网络药理学预测结果，对MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化水平进行检测。结果显示，毒黄素处理可明显上调JNK和p38的磷酸化水平，而对ERK影响不显著。这种选择性激活可能与多种因素相关：其一，ERK通路主要响应生长因子、丝裂原等促增殖信号，而JNK/p38通路属于应激激活蛋白激酶通路，更易被细胞毒性物质、氧化应激、细胞膜损伤等病理性刺激所激活。毒黄素作为细胞毒性物质，更倾向于激活JNK/p38；其二，不同MAPK亚型的上游激酶家族存在严格的底物特异性，毒黄素可能仅通过特定胞内信号激活JNK/p38上游激酶模块，而不触发ERK通路的上游激活。上述结果提示MAPK信号通路是毒黄素发挥细胞毒性效应的核心通路，其具体机制可能为毒黄素通过激活MAPK通路的JNK和p38磷酸化级联反应，调控下游促凋亡相关蛋白的表达，最终抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。此外，分子对接验证结果显示，毒黄素可与JNK及p38蛋白形成稳定结合构象，提示二者可发生直接相互作用。这一结果从分子层面为毒黄素激活JNK/p38的相关机制提供了直接佐证。
除MAPK通路外，KEGG分析还富集到PI3K-AKT、ErbB、Ras等信号通路。这些通路均在细胞存活、增殖与凋亡调控中扮演重要角色，同样可能在毒黄素引起的细胞毒性中发挥一定作用。PI3K-AKT通路激活后可通过磷酸化Bcl-2相关死亡促进因子（Bad）及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制凋亡、促进增殖，毒黄素可能通过抑制PI3K-AKT信号通路，协同增强毒性效应；ErbB通路以EGFR、ErbB2等受体酪氨酸激酶为核心，其与配体结合后可激活下游相关通路，调控细胞增殖与存活。该通路的富集提示毒黄素可能通过抑制ErbB通路阻断下游增殖信号传导抑制细胞增殖能力；Ras通路是连接细胞膜受体与下游通路的关键枢纽，通过鸟苷二磷酸/鸟苷三磷酸（GTP）结合状态转换调控通路激活。毒黄素或可通过干扰其GTP结合活性，影响下游信号通路的正常传导，进而造成细胞增殖受到抑制、凋亡加剧并放大细胞损伤效应。总之，毒黄素可能通过调控上述多条通路的动态平衡，弱化细胞存活相关信号、强化应激与凋亡信号，最终协同放大其细胞毒性作用，相关具体调控模式仍有待后续深入研究。
综上，本研究结合网络药理学与体外细胞实验，揭示了毒黄素通过激活MAPK信号通路诱导细胞凋亡并抑制增殖的分子机制。研究结果深化了对毒黄素毒性作用的理解，为相关食物中毒的防控提供了新的理论依据，也为潜在治疗靶点的筛选提供了新思路。但本研究仍存在一定局限性，为进一步明确MAPK通路激活与毒黄素介导的细胞毒性之间的因果关联，后续可引入MAPK通路特异性抑制剂开展干预阻断实验；此外，为更全面解析毒黄素诱导的MAPK通路磷酸 化动态变化规律，可进一步设置密集时间梯度开展检测分析，以阐释该通路介导毒黄素细胞毒性的内在调控机制。未来可在此基础上，进一步探讨其他富集通路在毒黄素毒性中的作用，并开展体内实验验证，以推动防治策略的转化应用。
引文格式：
陈晶, 刘斌, 李芸, 等. 基于网络药理学探讨毒黄素通过MAPK通路对细胞毒性的影响[J]. 食品科学, 2026, 47(12): 52-60. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20260105-026.
CHEN Jing, LIU Bin, LI Yun, et al. Network pharmacology-based investigation of the cytotoxicity-inducing effect of toxoflavin via the MAPK pathway[J]. Food Science, 2026, 47(12): 52-60. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20260105-026.
实习编辑：陈师昀；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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