副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种常见的嗜盐性、革兰氏阴性病原菌，广泛存在于各类水产品中，包括鱼类、贝类和虾类等，是引起水产品相关细菌性食物中毒的主要病原菌之一。作为一种重要的食源性致病菌，V. parahaemolyticus感染可导致人类出现腹泻、恶心、呕吐、腹部绞痛和头痛等一系列胃肠道损伤，严重时甚至可发展为败血症等致命性疾病，对人类健康构成极大威胁。在水产养殖业中，V. parahaemolyticus还可引发水生动物的急性或严重胃肠炎感染，造成显著的经济损失。因此，开发快速、灵敏的V. parahaemolyticus检测技术，对于实现该病原体的早期诊断与有效防控，保障水产品质量安全至关重要。
目前，针对V. parahaemolyticus的检测方法主要包括传统微生物培养法和常规分子生物学方法。其中，传统培养与生化鉴定法被认为是检测V. parahaemolyticus的“金标准”，但该方法操作繁琐、耗时费力，通常需要数天才能获得结果。基于核酸扩增的聚合酶链式反应（PCR）及其衍生技术（如实时荧光定量PCR（qPCR））的分子检测方法，具备较高的灵敏度和特异性，已被广泛用作检测V. parahaemolyticus的替代方案。然而，此类方法依赖昂贵仪器设备且检测流程通常需要1.5～2 h左右，难以在养殖现场检测中进行普及应用。为突破上述局限，环介导等温扩增（LAMP）与重组酶辅助扩增。例如，部分基于LAMP的检测方法对V.parahaemolyticus的检出限在103～105 CFU/mL之间，而RPA/RAA方法则通常在102～104 CFU/mL范围内。
为进一步提升恒温扩增技术的检测灵敏度，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白如CRISPR相关蛋白12a（Cas12a）系统被引入检测体系。该系统通过与RAA/RPA技术联用，在核酸快速检测中展现出高灵敏度、强特异性等优势，具有广阔的应用前景。目前该技术已成功应用于多种食源性病原菌的检测中，如V. parahaemolyticus、哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）、创伤弧菌（Vibriovulnificus）、沙门氏菌（Salmonella）、嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）等。现有大多数基于RAA/RPA和CRISPR/Cas12a的检测方法仍需要“两步法”进行，即先完成RAA/RPA等温扩增，然后开盖转移扩增产物进行CRISPR/Cas12a信号检测。这种操作流程显著增加了气溶胶污染的风险，极易导致假阳性结果，而且也增加了检测程序的复杂性。为解决上述问题，已有研究采用“一管式”策略在空间或时间上分离扩增与检测反应，以降低污染风险。这些策略主要包括物理分隔（如利用蔗糖浓度密度差、疏水油相或将Cas12a试剂预置于管盖或无菌注射器中）与化学调控（如通过光化学调控或酶化学调控）等方式。其中，物理分隔策略因操作直观、兼容性好而被广泛应用。
尽管针对V. parahaemolyticus的CRISPR/Cas12a检测方法已有若干报道，例如基于化学增强的RAA-CRISPR荧光检测、结合末端转移酶延伸的信号放大策略以及RPA-CRISPR与免疫层析试纸条联用的可视化平台。其中，仅Lv Xinrui等采用“一管式”设计，通过离心触发混合实现闭管检测，其余方法仍多依赖开盖操作或多步反应。此外，针对V. parahaemolyticus的CRISPR检测多集中于tdh、tlh等毒力基因，而将“一管式”RPA-CRISPR检测策略与ToxR基因靶向结合的研究仍相对有限。ToxR基因作为V. parahaemolyticus的一种毒力调控基因，广泛存在于不同菌株中，具有高度的种内保守性，是进行早期筛查和种属鉴定的理想靶标。
因此，为提升检测便捷性并突破现有V. parahaemolyticus检测技术的局限，福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所的刘兰英、吕新、饶秋华*等选取V. parahaemolyticus高度保守的ToxR基因为检测靶标，通过精准定位其与非靶标弧菌序列差异显著的高变区，将RPA技术与CRISPR/Cas12a系统相结合。通过优化反应体系，采用基于离心触发混合的物理分隔策略，建立一种兼具高灵敏度、高特异性且操作简便性的“一管式”RPA-CRISPR/Cas12a技术，以实现对V. parahaemolyticus的快速检测，从而为该病原体的早期预警与精准防控提供技术支撑，有效保障水产养殖业的健康发展。
1 一管式RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立
首先对不同来源的V. parahaemolyticus菌株ToxR基因的同源性进行分析，获得一段在V. parahaemolyticus中高度保守的片段。通过多重比对分析，选取V. parahaemolyticus与其近似种序列有明显差异处设计特异性引物，并同时满足片段中含有PAM序列（TTTN）（图1），在上述筛选出的特异性保守区内设计了3 对RPA引物（表1）。
RPA引物的扩增效率是决定整个检测方法灵敏度的关键前提，为建立RPA结合CRISPR/Cas12a的一管式V. parahaemolyticus快速检测方法，首先对设计的RPA引物扩增效率进行评估，由图2A可知，所设计的3 对RPA引物均可实现目的片段扩增，但其扩增效率与特异性存在显著差异。其中，引物对RPA-F1/R1与RPA-F2/R2扩增条带虽亮度较高，但在V. alginolyticus和V. cholerae中均出现了明显的非特异性扩增，表明其特异性不足，不适用于后续方法的构建。引物对RPA-F3/R3不仅在131 bp处扩增出清晰、明亮的单一目的条带，且仅在V. parahaemolyticus中有效扩增，在其余弧菌中均无非特异性扩增。这意味着，引物对RPA-F3/R3能够高效结合V. parahaemolyticus的特异性保守序列，同时有效避免与非靶标弧菌的基因组发生交叉反应，从而确保了检测方法的高度特异性。综上，引物对RPA-F3/R3具有良好的扩增效率与高度特异性，因此确定其为用于V. parahaemolyticus检测的最佳RPA引物对。
进一步对筛选出的最佳引物对RPA-F3/R3和设计的crRNA进行验证。以提取的V. parahaemolyticus菌株基因组DNA为模板，分别配制RPA体系和CRISPR/Cas12a检测体系后，将上述2 组体系在同一反应管内不同位置分布，当反应管中RPA程序完成后，将CRISPR/Cas12a检测体系注入即可完成一管式检测。由图2B可知，含V. parahaemolyticus基因组DNA的检测结果在紫外光下发出肉眼可见的荧光信号，同时在蓝光仪下可观察到绿色荧光信号。相反的，非靶标弧菌基因组DNA的检测结果在紫外光和蓝光仪下肉眼均观察不到荧光。这一结果表明，研究所设计的crRNA与靶标V. parahaemolyticus的RPA产物能够完全互补，从而高效激活Cas12a蛋白，产生显著的荧光信号；而对于非靶标弧菌的扩增产物，由于其序列存在大量错配，无法有效引导Cas12a进行识别和切割。该结果有力地证实了crRNA与靶序列的精确互补配对是激活Cas12a蛋白反式切割活性的先决条件。
综上所述，本研究建立的一管式RPA-CRISPR/Cas12a检测方法具有良好的可行性。该方法的核心优势在于将RPA与CRISPR/Cas12a检测整合于同一反应管中，实现了“扩增-检测”一体化操作。这样的设计不仅简化了操作流程，也显著降低了气溶胶污染的风险，提升了检测的稳定性和可操作性。
2 一管式RPA-CRISPR/Cas12a检测条件优化
2.1 crRNA浓度的优化
crRNA可与Cas12a蛋白形成二元复合物，特异性识别靶标DNA，从而激活Cas12a蛋白的“反式切割”活性。因此选择合适的crRNA浓度，对于建立有效的CRISPR/Cas12a检测体系至关重要。设置crRNA终浓度分别为100、150、200、250 nmol/L和300 nmol/L 5 个梯度进行RPA-CRISPR/Cas12a反应。由图3A可知，5 个处理组的荧光信号强度在整个扩增过程中持续上升且均显著高于相应的对照组，对照组的荧光信号始终维持在较低水平，变化不明显。如图3B所示，当crRNA浓度为100 nmol/L和150 nmol/L时，两组终荧光强度高于其他组，分别为3.77和3.89，且两者间无显著差异（P＞0.05）；当crRNA浓度继续增加时，其终荧光信号强度反而下降，可见过量的crRNA不利于其与Cas12a蛋白有效结合，这与之前的报道结果一致。分析原因可能是：当crRNA浓度过高时，体系中存在的大量游离crRNA会与已结合在Cas12a蛋白上的crRNA竞争有限的蛋白结合位点，这种竞争性结合干扰了Cas12a-crRNA复合物的形成效率和稳定性；此外，大量游离的crRNA分子还会非特异性地吸附在靶标DNA模板或其他反应组分上，增加了空间位阻，间接阻碍了Cas12a-crRNA复合物与靶标DNA的有效结合，从而降低了反应效率。结合蓝光和紫外光条件下观察结果，含靶标DNA的反应管中液体均呈现出明显的荧光信号，且荧光强度较高（图3C），表明靶标DNA被有效检测到；相反，不含靶标DNA的反应管则无明显荧光信号。综合考虑荧光强度与成本因素，最终选择100 nmol/L的crRNA浓度进行后续实验。
2.2 Cas12a与crRNA浓度比的优化
在RPA-CRISPR/Cas12a体系中，Cas12a与crRNA的浓度比例是决定检测性能的关键因素之一。为优化检测性能与成本效益，进一步对Cas12a与crRNA浓度比例进行筛选。固定crRNA浓度为100 nmol/L，设置0.5∶1、1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1和2.5∶1共5 个浓度比例进行测试。由图4A可知，5 个处理组的荧光信号强度在整个扩增过程呈先增加后稳定的趋势，但各组间差异不显著，且均极显著高于相应的对照组（P＜0.01），对照组的荧光信号始终维持在较低水平。由图4B可知，当Cas12a与crRNA浓度比为1.5∶1时，检测体系获得最高荧光强度，为5.04；其次是两者浓度比为0.5∶1时，荧光信号为5.03。由图4C可知，含靶标DNA的反应管中液体均呈现出肉眼可见的荧光信号，不含靶标DNA的反应管则无明显荧光信号。基于试剂成本考虑，确定Cas12a与crRNA最佳浓度比为0.5∶1，即Cas12a终浓度为50 nmol/L。Wang Jinbin等在建立V. parahaemolyticus检测方法时同样发现，Cas12a与crRNA浓度比为0.5∶1（即1∶2）时反应效果最佳。类似地，Chen Yanju、段红雯等在基于CRISPR-Cas12a的检测技术研究中也得出相同结果。这些研究共同表明，在CRISPR/Cas12a检测体系中，当Cas12a与crRNA的浓度比为1∶2时，可以确保几乎所有Cas12a蛋白都能与crRNA结合形成有效的Cas12a-crRNA复合物，从而使CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性达到最高。
2.3 FQ探针与Cas12a浓度比的优化
FQ探针在RPA-CRISPR/Cas12a体系中充当荧光报告分子，其与Cas12a的浓度比例对检测灵敏度的影响至关重要。为全面提升检测性能，进一步对FQ探针与Cas12a浓度比进行筛选。固定crRNA浓度为100 nmol/L，Cas12a浓度为50 nmol/L，设置1.6∶1、1.8∶1、2.0∶1、2.2∶1和2.4∶1共5 个浓度比进行测试。由图5A可知，5 个处理组的荧光信号强度在整个扩增过程中总体呈先上升后平缓的趋势，随着FQ探针与Cas12a浓度比的升高，体系荧光信号逐渐增强。当浓度比为2.4∶1和2.2∶1时，体系荧光信号强度最高，分别为8.00和7.27（图5B），且均在检测10 min左右就达到饱和状态，包含RPA预扩增在内的整个检测过程耗时不超过30 min。结合图5C可知，含靶标DNA的反应管中液体均呈现出肉眼可见的荧光信号，不含靶标DNA的反应管则无明显荧光信号。基于荧光强度与试剂节约双重考量，最终选择FQ探针与Cas12a最佳浓度比为2.2∶1，即探针终浓度为110 nmol/L。上述结果表明，CRISPR/Cas12a探针浓度越高，荧光强度越强，这与葛辉等在沙氏弧菌检测方法构建中观察到的现象一致。类似地，张晓琪等在基于RAA-CRISPR/Cas12a的检测技术研究中也表明荧光信号强度与探针浓度呈正相关。该现象证实了荧光探针作为Cas12a反式切割反应的底物，其浓度高低直接决定了最终信号输出的强弱。
3 方法灵敏度的评估
为评估本研究建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法的分析灵敏度，采用梯度稀释的V. parahaemolyticus基因组DNA（10～10-4ng/μL）与菌液（105～101 CFU/mL）进行检测。由图6A可知，质量浓度为101、100、10-1、 10-2、10-3 ng/μL的基因组DNA样品均能产生明显的荧光信号。随着基因组DNA质量浓度的降低，其荧光信号强度逐渐减弱。当基因组DNA质量浓度降至10-3 ng/μL时，仍可通过肉眼观察到荧光，其荧光信号强度与非模板对照之间存在显著差异（P＜0.05）；而质量浓度为10-4 ng/μL的基因组DNA样品，产生的荧光信号微弱，与非模板对照之间差异不显著（P＞0.05）。因此，确定所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法最低检测质量浓度为 10-3 ng/μL。综上，本方法能够检测到V. parahaemolyticus核酸的皮克级微量靶标（1.0 pg/μL），表现出良好的检测性能。这一灵敏度水平充分体现了RPA与CRISPR-Cas12a联用的技术优势。为验证该方法对V. parahaemolyticus的实际检测灵敏度，进一步对菌液浓度进行定量分析。如图6B所示，随着菌液浓度的降低，其荧光信号强度也逐渐减弱，肉眼可观测到荧光信号的菌液浓度阈值为102 CFU/mL。
为更全面评估本方法的性能，表2列出了现有针对V. parahaemolyticus主流检测技术的关键参数。由表2可知，本方法与已报道的RPA-CRISPR/Cas12a-ICS平台（检出限1.4×102 CFU/mL）相比，灵敏度处于同一数量级，表现出相当水平的检测能力。相较于LAMP-CRISPR/Cas12b方法（检出限3.7×101 CFU/mL）和CE-RAA-CRISPR方法（检出限6.7×101 CFU/mL），本方法灵敏度略低。然而，LAMP-CRISPR/Cas12b方法需要长达数小时的检测与富集时间，而CE-RAA-CRISPR方法则依赖化学添加剂（牛血清白蛋白与L-脯氨酸）以增强CRISPR信号，这也增加了体系复杂性。本研究通过优化反应条件，在未引入化学增强剂的情况下，仍实现了较高的灵敏度，并具备一管式、快速检测（＜30 min）的优势。此外，与高通量检测的多重PCR方法（检出限约104 CFU/mL）相比，本方法在灵敏度上也表现出明显优势。值得注意的是，由于不同研究在DNA提取方法、模板来源与检测平台等方面存在差异，上述比较主要基于文献报道数据，旨在提供不同方法在典型条件下的性能参考。
4 方法特异性的评估
采用所有供试菌株的DNA作为模板，对建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的特异性进行评估。除了2 株V. parahaemolyticus出现阳性扩增，其他8 种菌株以及非模板对照均无扩增现象。2 株V. parahaemolyticus的荧光信号强度均极显著高于非模板对照（P＜0.01），其他8 种菌株的荧光信号强度与非模板对照组无显著差异 （图7A）。结合蓝光仪和紫外条件下观察结果， 1、2号管中的液体均呈现出肉眼可见的荧光信号，其余各组管中的液体无明显荧光信号（图7B）。这表明本研究所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法对V. parahaemolyticus检测具有优异的特异性，与选定的多种供试菌株基因组DNA无交叉反应。该方法的高特异性源于其双重特异性识别机制：首先，在RPA阶段，针对V. parahaemolyticus保守序列设计的引物能够特异性识别并扩增目标片段，从而在核酸水平上实现初步筛选。其次，随后的CRISPR-Cas12a检测阶段提供了更严格的序列特异性验证，Cas12a蛋白只有在crRNA与靶标DNA序列实现完全互补配对时才会被激活，进而启动反式切割并产生荧光信号。这种“扩增筛选”与“序列精确识别”的相结合，显著提升了检测的可靠性。
5 人工污染样品检测
为进一步评估所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法在实际应用中的性能，以模拟V. parahaemolyticus感染的鱼肉样本为对象，通过与常规qPCR方法进行比较，验证该检测体系的可靠性。由表3可知，RPA-CRISPR/Cas12a方法对V. parahaemolyticus的检出限达1.5×100 CFU/mL，说明可以从1.5 CFU/mL V. parahaemolyticus污染的鱼肉组织中稳定检出病原，与qPCR方法的检出限一致。Kappa检验结果显示，2 种检测方法的总体符合率为100%，Kappa系数为1.0，灵敏度和特异性均为100%。由此表明，本研究建立的RPA-CRISPR/Cas12a在人工污染样品中的检测灵敏度与传统qPCR方法相当，2 种方法在非模板对照样品中均未出现假阳性扩增结果，证实了其良好的特异性。两者定量相关性分析显示（图8），RPA-CRISPR/Cas12a的荧光强度值与qPCR的Ct值之间存在负相关关系（相关系数r＝-0.974，P＜0.01），表明2 种方法的定量结果具有高度一致性。该结果与近期多项关于CRISPR检测技术的研究结果一致，进一步印证了本方法的可靠性。然而，传统qPCR方法高度依赖于精密的热循环仪实现温度精确控制，而RPA-CRISPR/Cas12a法整个检测过程无需依赖复杂的实验设备，仅需恒温条件即可完成，且检测时间大幅缩短，因此更适用于V. parahaemolyticus的现场检测。
值得注意的是，尽管本研究所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法在鱼肉基质中表现出良好的检测性能，但当前结果主要基于成分相对单一的基质，尚未涉及贝类、虾、即食海蜇等复杂实际样本。未来工作需进一步拓展至真实复杂样本的盲测验证，系统评估腐殖酸、多糖、脂肪等常见基质抑制物对检测效率的影响，并综合考察该方法在基层监管、养殖场快速筛查及冷链运输监测等环节中的应用可行性。
结 论
本研究通过设计特异性RPA引物及特异性crRNA，优化crRNA浓度、Cas12a与crRNA及FQ探针的浓度比例，建立一种用于V. parahaemolyticus检测的一管式RPA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测体系，并对该体系的灵敏度及特异性进行评估。结果显示，当crRNA终浓度为100 nmol/L、Cas12a与crRNA浓度比为0.5∶1、FQ探针与Cas12a浓度比为2.2∶1时，RPA-CRISPR/Cas12a体系能获得更佳的荧光强度（7.27），实现了在37 ℃恒温条件下30 min内完成从核酸扩增到CRISPR检测的全过程。该方法灵敏度高，对纯培养V. parahaemolyticus的检出限可达102CFU/mL，对模拟污染样品的检出限为1.5 CFU/mL，且与qPCR结果高度一致；同时具有良好的特异性，与其他常见病原菌无交叉反应。一管式反应的设计不仅简化了操作步骤，降低了气溶胶污染风险，还显著提高了检测的便捷性与稳定性。因此，本研究建立的分析方法有效结合了RPA的高扩增效率与CRISPR/Cas12a的高特异性识别能力，显著提高了V. parahaemolyticus检测的准确性与灵敏度，能够满足水产品中极低病原载量的监测需求，在水产养殖病害监控及现场快速诊断等领域具有一定的应用潜力。
引文格式：
刘兰英, 吕新, 黄薇, 等. 基于RPA-CRISPR/Cas12a技术的副溶血弧菌一管式快速检测方法[J]. 食品科学, 2026, 47(12): 346-355. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251217-140.
LIU Lanying, LÜ Xin, HUANG Wei, et al. A rapid one-tube detection method for Vibrio parahaemolyticus based on RPA-CRISPR/Cas12a[J]. Food Science, 2026, 47(12): 346-355. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251217-140.
实习编辑：陈师昀；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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