食源性致病菌引发的公共卫生安全挑战已构成全球健康体系及社会经济可持续发展的重大威胁。沙门氏菌主要通过受污染的食物（如肉类、蛋类、乳制品等）和水源传播，极易引发食源性疾病，防控难度大。沙门氏菌感染的临床表现多样，可从自限性胃肠炎发展为严重败血症或伤寒。该菌环境适应力强，能在低温、干燥条件下长期存活，且对抗生素的耐药性日益增强，因此建立快速检测方法对预防疫情、保障产品质量至关重要。
沙门氏菌属包含众多血清，其中鼠伤寒沙门氏菌是最常见且危害较为显著的血清型之一，其具有广谱宿主适应性（可感染人类及多种动物）、高发的食源性传播特征（占全球沙门氏菌感染病例的20%～40%）以及日益严峻的多重耐药性（如ST34、DT104等流行克隆），已成为公共卫生监测的重点病原体。鼠伤寒沙门氏菌属于B群沙门氏菌（O抗血清），是重要的人畜共患病病原体。流行病学数据显示，全球每年约有9 380万 例沙门氏菌感染病例，导致15.5万 例死亡。据美国疾病控制与预防中心统计，美国每年约135万 人感染，2.65万 人住院，420 人死亡。在中国，沙门氏菌为仅次于副溶血弧菌的第二大食源性病原体，我国现行标准GB/T 13091—2018《饲料中沙门氏菌的测定》明确规定饲料和饲料产品中不得检测出沙门氏菌。鼠伤寒沙门氏菌感染多表现为急性胃肠炎，潜伏期约6～12 h，病程平均持续10 d，感染后排菌期长，儿童可达49 d；免疫缺陷宿主易引发侵袭性感染，出现稽留热、肝脾肿大等并发症，严重者可发展为脓毒血症。近年来，鼠伤寒沙门氏菌对氯霉素、氨苄西林等一线药物耐药性增强，并对氟喹诺酮类药物敏感性下降，已被世界卫生组织列为重点监测的耐药病原体。
纳米抗体（Nb）作为新型生物识别分子，具有传统抗体难以比拟的独特优势。其分子质量小（约15 kDa），仅包含单一可变结构域，不仅易于基因工程改造和微生物系统高效表达，还具备出色的组织穿透能力。1993年首次鉴定出一类天然缺失轻链的重链抗体，其抗原结合功能仅存在重链可变区。后续研究证实，鲨鱼等软骨鱼类体内也存在同源的重链抗体，称为鲨鱼抗体，进一步丰富了Nb的来源体系。
Nb表现出极高的稳定性，可耐受高温、极端pH值和蛋白酶降解，适用于复杂环境下的检测或治疗应用。其抗原结合表位更丰富，能识别传统抗体难以触及的隐藏位点，展现出高亲和力与特异性。这些特性使Nb在疾病诊断、靶向治疗和生物传感等领域展现出巨大潜力，为生物医药与检测技术发展提供了新的工具。近年来，Nb作为一种新型的单域抗体，其独特的三维结构赋予其超越传统抗体的多重优势。在食品安全检测、疾病诊断、药物开发等领域展现出广阔的应用前景，为这些领域注入了全新活力。
目前常用检测方法包括传统培养法、聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）等，但存在灵敏度低、操作繁琐或成本高等局限。已有研究利用特异性Nb建立双抗体夹心化学发光ELISA，其灵敏度显著优于传统方法。本团队前期构建的检测体系为食品和饲料中鼠伤寒沙门氏菌的快速筛查提供了新技术，在保障食品安全、防控疾病传播方面具有重要价值，也为Nb在食源性病原检测中的应用提供了理论支持。山西农业大学动物医学学院王潇惠、古少鹏*、何金鑫*等旨在筛选鼠伤寒沙门氏菌特异性Nb，并建立双抗夹心ELISA快速检测方法。通过免疫羊驼构建Nb文库，利用噬菌体筛选特异性Nb-16，结合兔多抗建立检测方法，实现对食品中鼠伤寒沙门氏菌的快速、灵敏检测。
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兔血清IgG对鼠伤寒沙门氏菌特异性评价
如图1A所示，纯化后兔IgG在50 kDa附近有一条重链，在25 kDa附近有一条轻链，符合预期条带分子质量，可以满足后续ELISA的使用条件。使用间接ELISA测定纯化兔血清IgG的效价，以兔血清IgG稀释倍数为横坐标、OD450 nm为纵坐标，绘制兔血清IgG效价图（图1B），可以看出第5次免疫后机体产生抗体效价达1∶24 300，能够满足后续实验要求。
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Nb基因的扩增及噬菌体文库的鉴定
获取淋巴细胞后提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳可看到清晰的28S和18S条带（图2A）。反转录为cDNA，用F-R1/F-R2引物分别扩增Nbs基因，回收后在450 bp处可见清晰的目的条带（图2B）。将扩增的Nb基因使用Sfi I限制性内切酶进行酶切后回收单一条带，将pComb3XSS质粒用Sfi I进行酶切，可得到3 500 bp和1 500 bp两条带（图2C）。对3 500 bp的目的片段切胶回收，经NanoDrop超微量紫外-可见光分光光度计测定其浓度得到酶切后的Nb-R1基因质量浓度约32 ng/µL，Nb-R2基因质量浓度为41 ng/µL，酶切后质粒质量浓度约为19 ng/µL。将酶切后的Nb基因和pComb3XSS质粒进行连接，电转至ER2738感受态细胞构建Nb初始文库，经计算初始文库库容为1.10×1010 CFU/mL；挑选48 个随机单克隆进行插入率的鉴定，插入率达到100%（图2D），经辅助噬菌体拯救后库容达到1.80×1013 PFU/mL，文库库容达到了淘选特异性Nb的要求，可以用于后续淘选。
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噬菌体库阳性克隆筛选
以鼠伤寒沙门氏菌（CMCC 40994）灭活苗作为包被抗原，通过4 轮固相筛选，输出量得到明显富集（表2）。随机挑取56 个单克隆通过噬菌体-ELISA验证抗原抗体结合活性，判断其特异性与亲和力。经过噬菌体-ELISA多次验证后，实验值≥2×空白值即为阳性。随后将数值较高的16 个克隆（图3A）送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。结果显示，其为同一条氨基酸序列（图3B），命名为Nb-16，提取质粒转入BL21（DE3）PLysS感受态细胞进行表达。
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Nb表达与纯化
Nb可在大肠杆菌系统大量表达，基于前期噬菌体-ELISA筛选结果，选择Nb-16进行后续的表达与纯化。从阳性克隆的培养菌液中提取质粒，经NanoDrop超微量紫外-可见光分光光度计测定其质量浓度为175 ng/µL。将该质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）PLysS感受态细胞中，进行过夜诱导表达。通过SDS-PAGE对诱导后的表达产物进行分析，结果如图4A所示。在上清液中约17 kDa处可见清晰条带，表明Nb-16在该系统中实现了可溶性表达。随后，采用镍柱亲和层析法对Nb-16进行纯化，纯化后的蛋白条带如图4B所示。在预期分子质量17 kDa附近呈现单一清晰条带，证实Nb-16已成功纯化。
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Nb对鼠伤寒沙门氏菌的作用效果
为检测Nb-16对鼠伤寒沙门氏菌的结合活性，将鼠伤寒沙门氏菌灭活苗与上样缓冲液混合，经变性处理后进行SDS-PAGE分析，以纯化Nb-16为一抗，以鼠抗6×His-HRP为二抗，利用Western Blot验证，结果见图5A。在35 kDa附近有一清晰条带，可知纯化的特异性Nb-16与鼠伤寒沙门氏菌结合且特异性良好。为进一步评估该检测方法的广谱适用性，使用鼠伤寒沙门氏菌同一血清型的不同菌株（CMCC 40994、ATCC 14028、SL1344、ST34、DT104）进行验证。如图5B所示，该抗体对所有测试菌株均表现出稳定的检测性能，证明Nb-16识别的表位在鼠伤寒沙门氏菌不同菌株间高度保守，为本方法的实际推广应用提供了有力支持。由图5C可知，该抗体在70 ℃孵育40 min后活性依然可达92%；80 ℃孵育40 min后活性可达84%；然而90 ℃孵育25 min后其活性仅为83%。酸碱度耐受性实验显示，该抗体在pH 3～5的缓冲液中孵育40 min，其活性均能达到80%以上；当在pH 2的缓冲液中孵育10 min后，其活性为74%（图5D），表明在高温、酸性的条件下，Nb-16仍具有较强的结合活性。
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鼠伤寒沙门氏菌双抗体夹心ELISA方法的建立
首先通过棋盘法确定包被捕获抗体和检测抗体最佳稀释倍数，结果如图6A所示。抗体兔血清IgG最佳稀释比为1∶1 000，检测抗体Nb-16最佳稀释比为1∶200。随后，采用3 种不同成分与浓度的封闭液分别封闭1 h后进行后续检测步骤，以阳性孔与阴性孔的吸光度比值（P/N值）最高作为最优封闭条件。ELISA结果显示，1%脱脂乳的封闭效果最佳（图6B）。随后，采用控制变量法对1%脱脂乳的封闭时间进行优化。封闭相应时间后继续后续检测，以P/N值最高确定最佳封闭时间。如图6C所示，封闭1 h与1.5 h的P/N值差异极显著（P＜0.01），因此后续实验选择封闭1.5 h进行检测。利用控制变量法摸索缓冲液的最佳pH值，以P/N值作为判断依据。由图6D可知，当PBS的pH值为9时检测效果最优，且与pH 7组相比差异极显著（P＜0.001）。建立双抗夹心ELISA法，以鼠伤寒沙门氏菌稀释液的浓度为横坐标、OD450 nm为纵坐标，建立标准曲线，经Logistic拟合分析可得回归方程（图6E），其EC50为6.071×105 CFU/mL，EC20～EC80为8.944×104～4.121×106 CFU/mL，并通过回归方程计算得出LOD为1.3×104 CFU/mL，LOQ为1.7×104 CFU/mL。
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双抗体夹心ELISA特异性分析
采用已建立的双抗夹心ELISA法检测其对他菌株的特异性，结果如图7所示。所建立的双抗夹心ELISA法对鼠伤寒沙门氏菌的特异性良好，对其他致病菌交叉反应不明显。
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实际食品样品的分析
为评估所建立的双抗夹心ELISA法在实际食品样本中的检测能力，以生菜为基质进行了加标回收实验。如表3所示，ELISA法在1.0×105、1.0×106 CFU/25 g条件下均表现出良好的检测性能。所有加标水平的平均回收率约为89%，表明该方法准确性高、重复性好。阴性对照样本未产生特异性信号，证明生菜基质对本检测无显著干扰。结果表明，本研究所建立的ELISA法适用于复杂食品基质中鼠伤寒沙门氏菌的快速、准确检测。
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讨论与结论
食品安全和质量的检验以及卫生的防控仍然是食品供应链的首要注意事项。欧洲食品安全局监测报告指出，受污染禽蛋及制品导致的沙门氏菌感染病例年均超9万 例，该病原体被列为欧盟食源性人畜共患病第二大致病源。沙门氏菌在细菌性食源性疾病中的占约比为25%，而鼠伤寒沙门氏菌在沙门氏菌感染中的占比约为20%～40%，是主要的致病血清型之一。因此，有效快速检测鼠伤寒沙门氏菌对于减缓食源性疾病的传播至关重要。目前，Nb在病原检测领域展现出广阔前景。本研究中筛选的Nb-16蛋白对鼠伤寒沙门氏菌具有高亲和力，并且Nb的小分子质量和耐高温等特性使其适用于试纸条、微流控芯片等便携式检测工具。在临床场景中，Nb可通过与荧光标记或电化学传感器结合，实现样本的快速诊断。
本研究成功制备鼠伤寒沙门氏菌的灭活苗并获得了纯化的鼠伤寒沙门氏菌兔抗IgG，同时构建了鼠伤寒沙门氏菌Nb免疫文库，免疫文库库容达1.10×1010 CFU/mL，插入率100%。通过辅助噬菌体救援，筛选并鉴定了针对鼠伤寒沙门氏菌的Nb（Nb-16）。该抗体可以特异性识别鼠伤寒沙门氏菌并且具有很高的亲和活性。最后，以纯化兔血清IgG作为捕获抗体、Nb-16作为检测抗体，优化封闭时间和PBS pH值条件，成功构建鼠伤寒沙门氏菌的双抗夹心ELISA分析方法，该方法EC50为6.071×105 CFU/mL，EC20～EC80为8.944×104～4.121×106 CFU/mL。LOD为1.3×104 CFU/mL，LOQ为1.7×104 CFU/mL。特异性验证该方法对其他常见致病菌无交叉反应。在生菜加标样本检测中，本ELISA法展现出高准确性（回收率约为89%）和重复性，且阴性对照样本未产生特异性信号，这表明Nb-16识别的表位保守且抗基质干扰能力强。本研究所建立方法可有效整合至现行国家标准检测流程中，作为增菌后的快速筛查手段，将传统数日的检测周期缩短至一个工作日以内，为蔬菜供应链中的沙门氏菌快速监测提供可靠技术方案。
双抗夹心ELISA方法通过捕获抗体与检测抗体的协同作用，显著提升了检测的特异性和灵敏度。基于识别不同抗原表位的策略，还可进一步设计同源或异源二聚体Nb，构建性能更优的检测体系。在食品安全快速筛查方面，传统沙门氏菌检测方法依赖实验室设备、耗时长，而本研究建立的双抗夹心ELISA仅需数小时即可完成检测，且无需复杂仪器支持。类似地，Gu Kui等采用夹心ELISA检测牛奶和鸡肉中的肠炎沙门氏菌，经8 h富集后，在牛奶中的检测灵敏度可达约10 CFU/mL，在鸡肉样本中的检测灵敏度为5×104 CFU/mL。将该方法推广至乳制品和禽类养殖企业或将有效降低食源性疾病暴发风险。在资源有限地区，高成本的分子检测技术难以普及。本研究通过优化抗体纯化工艺（如Ni柱亲和层析），进一步降低了试剂成本，使该ELISA法具备良好的推广应用前景。综上所述，本研究制备的鼠伤寒沙门氏菌特异性Nb及其配套双抗夹心ELISA检测方法在食品安全、临床诊断及环境监测等领域均具有重要价值。
通信作者
古少鹏教授，山西农业大学动物医学学院党委委员、山西农业大学动物疾病诊断研究中心主任、动植物检疫专业负责人。参编《兽医临床病理解剖学》《兽医病理学》《动物性食品卫生学实验教程》《兽医公共卫生与健康》《动物性食品卫生学》《动物检疫学》等国家级规划教材10 部，主编与参编出版《兔病防控与治疗技术》 《羊病防控与治疗技术》《牛病防控与治疗技术》《羊场兽医手册》等著作16 部；授权国家发明专利6 项，山西省高等学校科技成果一等奖1 项，山西省农村技术承包二等奖1 项，全国生态文明信息化教学成果奖1 项，制定山西省地方标准1 项，6 项课题经省科技厅鉴定达国际先进水平。 在Veterinary Research、Animal Feed Science and Technology、Agricultural Sciences in China、中国农业科学、畜牧兽医学报等学术期刊发表论文150余篇。曾获山西省高教工委优秀共产党员、山西农业大学“三育人”先进个人等荣誉。
何金鑫副 教授，中国畜牧兽医学会食品卫生学分会理事。主要从事食源性病原微生物快速检测技术研究。先后主持国家重点研发计划子课题、山西省青年科学基金、山西省高校科技创新项目等科研课题共8 项，并作为科研骨干参与国家重点研发计划及国家自然科学基金面上项目等4 项重要科研任务。目前以第一作者或通信作者身份发在《Analytical Chemistry》《Food Chemistry》《食品科学》等期刊发表论文约20 篇；获国家发明专利7 项。
第一作者
王潇惠，山西农业大学动物医学学院，硕士研究生，研究方向为预防兽医学。主持山西省2024年研究生实践创新项目，获得山西农业大学2024学年“优秀研究生”，获得2023-2024学年学业三等奖学金，获得2024-2025学年学业二等奖学金
引文格式：
王潇惠, 孙华博, 李茵, 等. 鼠伤寒沙门氏菌特异性纳米抗体的筛选及其双抗夹心ELISA方法的建立[J]. 食品科学, 2026, 47(12): 337-345. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251127-224.
WANG Xiaohui, SUN Huabo, LI Yin, et al. Screening for Salmonella Typhimurium-specific nanobodies and establishment of a double-antibody sandwich ELISA[J]. Food Science, 2026, 47(12): 337-345. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251127-224.
实习编辑：辉煌；编辑：阎一鸣；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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