在人类基因组的个体差异中，单核苷酸替换与长度不足50个碱基的插入缺失（indel）占据了绝大多数。这类小变异与人群遗传多样性、复杂性状以及孟德尔疾病密切相关，也是精准医学判读无法绕开的起点。过去十余年，短读长测序凭借高通量与高碱基质量，支撑了千人基因组、gnomAD与UK Biobank等大型计划，但其150～300 bp的读长难以覆盖更长的重复序列。当同一条读段可以同等地比对到多个位置时，分析流程通常只能将其丢弃，以避免假阳性。GRCh38中约8%、接近2亿个碱基的区域因此长期处于短读长的分析范围之外；考虑到参考基因组本身还缺失了大量重复序列，这一盲区的实际规模只会更大。
在这一背景下，香港大学罗锐邦团队与美国贝勒医学院、莱斯大学Fritz J. Sedlazeck合作，在Nature Reviews Genetics发表综述“Small variant calling in the era of long-read sequencing”。文章沿变异来源与测序模态两条线索展开：前者覆盖胚系、新发、嵌合与体细胞变异，后者涵盖DNA、bulk RNA与单细胞测序；在此基础上，作者比较了深度学习、从头组装与泛基因组图三类计算策略。文章的核心判断值得注意：长读长带来的真正改变不只是读长增加，它让物理连锁的单倍型关系成为可用的推断先验；而被频繁引用的99.9%准确率，统计范围仅限于高置信区域。
变异的来源不同，检测任务也随之不同。遗传性胚系变异存在于个体几乎所有细胞中，杂合与纯合位点的变异等位基因频率（VAF）分别接近50%和100%，这为算法提供了很强的统计约束。也正因如此，胚系检测的难点主要不在区分信号与噪声，而在于能否把变异定位到正确的基因组坐标。新发变异的情况更为复杂：这类变异起源于亲代配子或胚胎早期，单样本测序无法判断其来源，必须引入父母样本。长读长一方面把父母基因型作为先验，另一方面可跨多个杂合位点完成物理定相，从而确定变异位于母源还是父源单倍型。已有研究据此将UBE3A的新发致病移码变异定相至母源等位基因，为Angelman综合征的诊断提供了支持；duoNovo、HAT与Clair3-Nova等工具则能在数百万个遗传变异中筛出几十个新发事件，并同时给出亲本来源。
嵌合与体细胞变异呈现的是另一种分布。它们发生在受精之后，仅存在于部分细胞，VAF可从不足1%连续变化至接近杂合水平，并受发育时间、肿瘤纯度与亚克隆扩增影响。此时检测目标已从“杂合或纯合”的判定，转为对等位基因比例的定量估计；真实信号可能只有几百个，却要与数百万个噪声候选竞争。临床上仍以配对肿瘤—正常样本测序作为金标准；若缺少正常对照，则需借助正常样本库（panel of normals）来平衡灵敏度与精确度。传统方案往往要求200×至1000×的超深覆盖，而长读长的优势在于，它能显示一个低频变异是否与同一单倍型上的邻近等位基因连锁，再结合拷贝数变异给出的局部倍性信息，把原本会被过滤掉的候选重新召回。
图1.变异的发育起源、等位基因频率分布与2016—2025年小变异检测工具演进
测序平台的技术路线并不相同。PacBio采用环形一致性测序，对同一环化DNA分子反复读取，通过多轮观测抵消随机聚合酶错误，最终得到10～20 kb、准确率超过99.9%的高保真（HiFi）读段。ONT则记录DNA通过蛋白纳米孔时的电流变化，读长更具优势，优化条件下常超过100 kb，代价是更高的错误率。两者均直接测序天然DNA，因此碱基修饰信息可以在同一次测序中保留下来。
不过，长读长的错误分布并不均匀，序列语境的影响相当明显。ONT在重复区域容易出现indel错误，且错误随重复长度增加而累积，长同聚物与二核苷酸重复尤为突出；PacBio的残余错误也集中在同聚物附近。文章引用的几组数据颇能说明问题：PacBio约75%的不一致indel检出落在同聚物内部或邻近位置；在典型重复区，indel表现可降至约70%，长同聚物（>11 bp）中甚至低于20%；T2T-HG002基准显示，ONT原始读段的indel错误率约为PacBio的1.7倍。SMN1与SMN2在28 kb范围内序列一致性超过99.9%，即使读段足够长，比对歧义依然存在。可见，读段能跨过复杂区域，与变异能被准确判定，并不是一回事。
RNA与单细胞测序把这一问题的维度进一步拉开。长读长RNA测序将变异与表达直接关联：Iso-Seq与MAS-Seq利用HiFi读段构建全长cDNA目录，ONT的直接RNA测序则跳过逆转录与扩增，直接读取天然RNA分子。但RNA的覆盖度取决于基因表达水平，无法像DNA那样均匀铺展；等位基因特异性表达（ASE）可使杂合位点表现为纯合，甚至完全检测不到；A-to-I编辑与真实遗传变异在序列上难以区分；剪接接头附近的比对歧义又常被误判为小indel。到了单细胞层面，稀疏覆盖、等位基因脱扣、双细胞污染与环境RNA污染叠加在一起，细胞特异性变异往往只有极少的读段支持。文章据此强调，不同测序模态对应不同的误差结构，算法必须针对这些结构显式建模，而不能照搬DNA胚系检测的假设。
图 2.长读长DNA、bulk RNA与单细胞测序的分析流程及主要误差来源
无论面向哪种场景，现有流程大体遵循“比对—候选位点搜索—真伪判定”的框架。DeepVariant在PrecisionFDA挑战赛中的表现，证明了神经网络可以直接从比对堆叠中学习变异证据；此后，深度学习逐步取代基于规则和贝叶斯模型的方法。Clair系列进一步将SNP的F1提升至PacBio高置信区域的99.9%以上、ONT接近99%。
流程中最显著的变化，或许要数定相（phasing）角色的转变。过去它多被视为依赖群体连锁不平衡的事后处理步骤；长读长普及后，定相逐渐前移为模型的第一性先验。原因并不难理解：未定相时，低频杂合信号与随机测序错误在统计上难以区分；一旦读段被归入两条单倍型，真实变异便会在同一单倍型上形成一致的信号，而技术假象依旧随机分布。WhatsHap、LongPhase与Margin等工具可将离散的杂合位点连接成兆碱基级相位块；更新的方法还尝试利用等位基因特异性甲基化，在杂合位点稀少的区域延续相位。类似策略也被用于肿瘤与单细胞：前者以正常样本建立单倍型骨架，以避开肿瘤CNV的干扰；后者先构建伪批量骨架，再将读段分配回各个细胞。
证据如何表示，同样决定了模型的能力边界。Clair、NanoSNP等采用汇总式编码，把比对结果压缩成位点级的碱基计数与链方向统计，优点是计算效率高、对低覆盖稳健，缺点是丢失了同一条读段上的变异连锁，面对多等位与重叠indel时力不从心。DeepVariant与Clair3的全比对模块则保留读段级信息，包括碱基质量、链方向与indel，精度更高，但算力开销明显上升。网络结构的选择也遵循类似取舍：卷积网络善于捕捉局部模式，且便于GPU加速；循环网络用更少的参数整合两侧上下文；自注意力能够建模全局依赖，却受制于可处理的序列长度。
图3.基于深度学习的长读长变异检测流程与定相策略
只要参考坐标仍是单一线性序列，参考偏倚就难以彻底消除。T2T-CHM13补齐了约2亿个碱基的缺口，使一批此前无法分析的区域进入视野；但随之而来的问题是，新基准中93%的变异位于着丝粒卫星、串联重复等高复杂区域，而这些区域恰好缺少可靠的真值集。文章给出的HG002评估结果颇具说服力：即使采用高准确度HiFi读段，表现最好的算法在低可比对性与片段重复区域的召回率也分别降至SNP 95%和indel 85%，与其他区域99.9%以上的水平相去甚远；在3202个样本中，PacBio与ONT的SNP一致率总体仅约40%。
面对线性参考的局限，文章重点讨论了两条替代路径。从头组装走的是“先重建、后比较”的思路：先分别得到母源与父源的单倍型序列，再将其与参考基因组对齐以提取变异。这一策略的分辨率相当可观——contig N50可超过20 Mb，一致度达到Q50以上，单个基因组通常能稳定检出2.5万个以上的结构变异。以HG002为例，组装使X、Y染色体分别有94%与63%的区域进入可靠基准，294个医学相关基因中251个实现99%以上覆盖，另有约15%过去被视为“不可及”的序列被重新纳入分析。代价同样明显：算力约为比对流程的十倍，且极长同聚物中的gap尺寸估计会削弱indel精度。
另一条路径是泛基因组图。它把群体中的单倍型多样性组织成由节点和边构成的网络，读段不再被迫贴向单一线性序列，而是沿已有的生物学路径行进。按文章引用的数据，HPRC首版47个基因组的图参考可将小变异检测的假阳性与假阴性合计降低约34%；HPRC2在多个短读长平台上又把总体错误压低36.0%～52.4%。问题在于坐标：图参考没有稳定的线性坐标系，而临床注释与报告仍围绕GRCh37/38建立，分析结果不得不投影回线性坐标，恰恰在图结构最有价值的位置重新产生歧义。
图4.线性比对、从头组装与泛基因组图三种计算范式
文章还提出，应重新审视小变异与结构变异（SV）之间那条50 bp的分界。49 bp与51 bp的缺失在生物学上并无本质差异，这条界线更多是短读长时代的技术产物。两类变异沿同一单倍型相互影响：小变异在SV断点附近富集，重复区域内的小变异还会改变整体致病性。更需警惕的是一种判读风险——当较大的杂合缺失造成杂合性丢失时，若算法未能识别该SV，半合子小变异就可能被误判为纯合，进而影响临床结论。
文章最有分量的一节，是对“高准确率”的重新审视。目前广泛引用的性能数字，实际上局限于GIAB高置信区域，属于全基因组平均值。一个位于RPGR同聚物中的致病indel，或一个受SMN1/SMN2旁系同源干扰的单核苷酸变异，对总体F1的影响微乎其微，却可能直接决定患者能否获得诊断。因此，比起把99.9%继续推高，更迫切的任务是缩减算法在系统性失败区域的差距。
体细胞与嵌合检测中的差距尤为明显。肿瘤异质性与极低VAF不断压缩灵敏度空间；GIAB HG008等长读长真值集的建立，一方面提供了关键基准，另一方面也揭示出比对类算法在复杂区域和CNV高发区域的系统性漏检。要补上这一环，从头组装几乎是必经之路，但肿瘤的多克隆与非二倍体特性又使组装困难重重。新发与嵌合变异则面临样本稀缺：真实阳性数量有限，分类器训练不足，只能借助模拟数据，而模拟数据未必能反映真实的生物学过程。
文章最后把解决思路归纳为三点。其一是训练策略：借助大量未标注数据开展半监督学习，让模型见到更完整的突变谱系。其二是参考体系：算法应原生支持泛基因组图，把群体变异写进模型本身，而不是留到下游做校正；比对难以奏效的区域，则交由组装补位。其三是分析视角：从逐位点、垂直堆叠读段的模式，转向同时利用变异连锁、群体先验与长程单倍型依赖的“水平”基因组语境。
在作者看来，一个更根本的转变发生在问题本身——瓶颈正从“检出”移向“解释”。长读长不断在人群数据库缺席的区域发现新变异，而ClinVar与临床指南仍建立在GRCh37/38坐标上；接下来的难题，将不再是能否检出，而是能否读懂。
按照文章的梳理，长读长小变异检测已经历三次跃迁：从碎片化推断走向单倍型分辨的连续推断，从线性参考上的逐位点判定走向组装与图参考上的基因组语境建模，从追求平均准确率走向直面临床相关的复杂区域。对于正在推动长读长进入临床的基因组学共同体而言，这份综述既提供了技术路线，也列出了尚未解决的问题。
原文信息：
Zhenxian Zheng, Fritz J. Sedlazeck, Ruibang Luo. Small variant calling in the era of long-read sequencing. Nature Reviews Genetics, 2026. DOI: 10.1038/s41576-026-01020-7
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