近一个世纪前，显微学的一项突破为科学家提供了一种全新的观察细胞内部的方法。这项被称为相差显微术的技术，使此前微弱或几乎不可见的细胞结构变得更容易分辨。其重要性在1953年获得诺贝尔奖认可。
如今，加州大学伯克利分校的物理学家将同样的原理引入电子显微镜——一种放大能力约比传统光学显微镜高1万倍的技术。
研究人员开发出一种名为激光相位板的装置，可能显著改进冷冻电子显微镜（cryo-EM）。过去十年，这种强大的成像方法改变了蛋白质结构研究，并帮助加速药物发现。即便如此，它仍有一个主要局限：大多数人类蛋白质太小，获得清晰图像仍极其困难。
新激光技术可能帮助克服这一障碍，有望让科学家对大小仅为当前显微镜难以成像蛋白质三分之一的蛋白质成像。
更大的影响可能来自冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的改进。这种较新的方法将从多个角度拍摄的图像结合起来，构建蛋白质和其他分子的三维视图。与在溶液中研究分离分子的技术不同，cryo-ET能揭示蛋白质在其天然细胞环境中如何排列和相互作用。
“冷冻电镜已成为解析生物大分子结构的新兴、增长最快的方法，而cryo-ET有望展示这些分子在其天然细胞环境中如何协同工作，”领导这项开发工作的加州大学伯克利分校物理学教授、劳伦斯伯克利国家实验室 faculty scientist Holger Müller说。“但由于信噪比限制，大多数人类和动物蛋白质太小，无法用这些方法分析。激光相位板带来的信噪比提升有望克服这些重要限制。”
一种非凡激光揭示隐藏的细胞结构
这一突破依赖于研究人员所称的世界上最强的聚焦连续波激光。激光不是简单地照射样品，而是直接与显微镜的电子束相互作用，改变其相位以提高图像对比度。
这种调整使区分小分子（包括血红蛋白）与其周围环境更容易。它还可能提高细胞内部结构（如细胞核和线粒体）的可见度。
“借助cryo-ET，我们观察的是细胞内部极其拥挤的小而非常复杂的细胞物质，”加州雷德伍德城Biohub的创始成像技术总监Bridget Carragher说。“这就像一片森林，你要在其中一棵树上找到一片叶子。cryo-ET需要在对比度上取得显著跃升，这样我们才能开始看到细胞内部发生了什么。这正是激光相位板有望带给我们的。”
在Biohub的资助下，Müller购置了一台先进的冷冻电镜仪器，并为它配备了新的激光相位板。他将由此得到的显微镜命名为Theia（忒亚），取自与光和光辉有关的古希腊提坦女神。
与此同时，Carragher正在指导在Biohub位于雷德伍德城的成像设施中建造一台相关显微镜。她团队的仪器使用两束激光而非一束，基于Müller及其合作者进行的理论研究。
两束激光彼此成直角排列，每束功率约为一半。这种配置有助于防止组件烧毁，同时减少可能干扰图像质量的光学畸变。
两个研究团队都在与冷冻电镜仪器领先制造商赛默飞世尔科技合作。
“Theia是一级方程式显微镜，”Müller说。“它具有额外的电子光学系统，即使没有激光，分辨率也高于标准冷冻电镜。加上激光相位板后，我们希望它真正成为世界上总体最好的仪器。”
伯克利团队的最新图像和技术发现发表在《科学》杂志上。Biohub双激光设计的细节见最近发布的预印本。
一项诺贝尔奖发现如何改变显微术
要理解这项新技术为何重要，不妨看看生物成像中一个长期存在的挑战。
由于动植物细胞主要由水组成，在普通光学显微镜下观察时相对透明。尽管这种透明性看似有利，却带来了问题。包括线粒体和细胞核在内的小细胞结构散射的光很少，因此只比周围物质略暗。
传统上，科学家通过添加染色剂来产生更大对比度以解决这一问题。然而，染色也会杀死细胞。
1930年，荷兰物理学家Frits Zernike意识到，光穿过生物材料时的变化不止是变亮或变暗。当光在细胞内散射时，还会经历微小延迟，从而改变其相位，也就是波峰出现的时间。
尽管人眼无法直接检测这种相位偏移，Zernike发现它可以转化为可见的亮度差异。通过将未散射光的相位移动90度，他使细微细胞特征在光到达观察者眼睛时相对于背景更加清晰地凸显出来。
这一创新成为相差显微术的基础，使Zernike获得1953年诺贝尔物理学奖。
到20世纪40年代初，科学家已经认识到相差法在研究细胞方面多么有用。他们开始探索同样的思路能否改进电子显微镜——后者使用电子而非光来观察小至单个蛋白质的结构。
不幸的是，早期尝试遇到了严重技术困难。旨在改变电子束相位的装置往往使电子束过度减弱、引入图像不稳定性或降低分辨率。
2010年出现了一种可能的解决方案：Müller和Robert Glaeser（现为加州大学伯克利分校分子与细胞生物学荣休教授）提出用强激光产生所需相位偏移。他们的方法提供了一种在不牺牲电子束强度的情况下提高对比度的途径。
克服电子显微镜的局限
Glaeser在冷冻电镜的发展中发挥了重要作用。与传统X射线晶体学相比，冷冻电镜提供了一种可能更简单的确定分子结构的方法。
X射线晶体学要求研究人员培养待研究分子的晶体，并获得强X射线源。冷冻电镜避免了使分子结晶的需要，但也带来自身困难。
最大的问题之一是电子束会加热并最终损伤被检查的样品。这限制了可收集的信息量以及最终图像能达到的细节程度。用金属覆盖样品可以减少损伤并提高对比度，但也会使图像不那么清晰。
20世纪60年代，研究人员开始研究冷冻生物样品能否保护其免受辐射损伤。
Glaeser证明冷却样品有助于在成像过程中保护样品。他还提出使用强度较低的电子束一次性检查数千个冷冻分子，进一步限制损伤。
由于这些分子会以不同角度排列，计算机可以分析并合并它们的图像，从而重建高度详细的分子结构。
这些进展帮助奠定了现代冷冻电镜的基础，其开发者获得了2017年诺贝尔化学奖。诺贝尔奖得主在获奖感言中肯定了Glaeser的贡献。
诺贝尔委员会称赞这项技术，解释说冷冻电镜“既简化又改进了生物分子成像。这种方法已将生物化学带入新时代。”
驾驭超强激光的15年探索
将激光相位板概念转化为可工作的技术需要多年工程攻关。
在2010年提出设想后，Müller花了15年推进这一想法，部分研究得到美国国立卫生研究院支持。
第一个重大挑战是产生集中在小区域的极强激光束。研究人员需要足够的光强来将电子束相位改变90度。
开发必要系统花了十年。
他们的解决方案是将连续激光束限制在内衬镜面的球形腔内。当光在腔中反复反射超过1万次时，其强度急剧增加，同时光束被聚焦到极小光斑。
“这是将75千瓦聚焦到几微米，”Müller说。“这比焊接用的激光更强。它比军用激光功率更高。它形成了迄今最亮的连续激光焦点。”
团队首先通过将激光相位板安装到Glaeser的一台较旧电子显微镜中，证明了概念可行。
随后，Biohub的额外资助使团队得以购置一台定制的、最先进的Thermo Fisher Krios冷冻电镜显微镜，并对其进行改造以适配激光技术。
在最新研究中，科学家用六种大小和制备方法不同的样品测试了升级后的显微镜。激光持续提高了图像分辨率，对用标准方法难以成像的样品提升尤其重要。
“对于最具挑战性的情况——小颗粒、劣质样品——激光带来了非常可观的优势，”Müller说。
曾因太小而无法研究的蛋白质获得更清晰图像
为展示新显微镜的能力，研究人员重建了两种不同蛋白质的图像。
第一种是醛缩酶，一种存在于肌肉中的蛋白质，现代冷冻电镜系统已经可以相对容易地对其成像。第二种是血红蛋白，负责在血液中运输氧气的蛋白质。
血红蛋白小得多，接近传统冷冻电镜仪器能够可靠分析的蛋白质尺寸下限。
使用激光相位板，研究人员提高了两种蛋白质结构的分辨率。血红蛋白的提升尤其明显，凸显了该技术克服较小分子相关困难的潜力。
“归根结底，如果你有一个大蛋白质和非常好的样品——例如新鲜的样品或没有气泡的冷冻样品——你可能不需要相位板就能获得单张高质量图像。但对于小蛋白质和劣质样品，开启激光是最好的，”Müller说。“这可以填补我们对无法结晶或对当今冷冻电镜来说太小的蛋白质结构认知中的巨大空白。而且它将对cryo-ET具有革命性意义。”
蛋白质质量通常用道尔顿表示，这一单位以英国化学家John Dalton命名。一个道尔顿定义为一个碳-12原子质量的十二分之一。
传统冷冻电镜难以对小于约70千道尔顿的蛋白质成像。这一限制尤其重要，因为低于这一阈值的蛋白质约占人类蛋白质组的90%——蛋白质组是人体产生的全部蛋白质集合。
借助激光相位板，研究人员现在可以对小至50千道尔顿的蛋白质成像，尽管这样做仍然具有挑战性。这类蛋白质甚至比血红蛋白还小。
下一个目标是揭示更小的蛋白质
Müller认为，这项技术最终可能让科学家研究小至17千道尔顿的蛋白质（即肌红蛋白的大小）。
实现这一目标可能需要另一项改进：使用紧密聚焦的电子束，而不是目前在没有激光相位板时产生足够对比度所需的散焦电子束。
据Müller所说，激光系统应能使聚焦电子束中的相位变化直接产生对比度。
如果成功，这一调整可能使对比度和信噪比再次翻倍，在激光相位板已实现的提升之上进一步增强。
这样的进展可能使研究人体蛋白质中大得多的比例成为可能，并为它们如何在复杂细胞环境中相互作用提供前所未有的洞见。
“这项技术对生物学而言是阶跃式变化，”Biohub成像科学副总裁Stephani Otte说。“我们将首次能够在真实情境中看到分子机器如何在活细胞内运作。曾经不可见的东西将变得可见——这将改变我们理解疾病的一切方式。”
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