酚酸是一类廉价易得的天然可再生原料，可通过生物合成途径转化为相应的4-乙烯基衍生物。该类衍生物具有独特的挥发性香气特征与极低的感官识别阈值，作为风味调节剂广泛应用于果酒、啤酒及其他发酵食品与饮料中，并已被批准为合法食品添加剂。酚酸脱羧酶（EC 4.1.1.102）是催化酚酸非氧化脱羧反应生成4-乙烯基衍生物的关键酶。然而，目前研究中使用的天然来源PAD普遍存在催化活性有限、稳定性较差、纯化过程复杂等问题，严重制约其工业化应用潜力。异源表达已成为生产工业用酶的一项关键技术。实验室前期研究筛选到1 株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）RS20D，将该菌株中提取的PAD与咖啡酸、对香豆酸、芥子酸、阿魏酸4 种底物进行反应，测定其对不同底物的比活力，发现该酶对咖啡酸的比活力明显高于其他3 种底物。目前已有对对香豆酸、阿魏酸和芥子酸3 种底物具有高催化活性的PAD的相关研究报道，如CgPAD和BLPAD。但对咖啡酸具有高催化活性的PAD报道极少。仅Rodríguez等对源自植物乳植杆菌CECT 748T的PAD的酶学性质进行研究，发现该酶对咖啡酸具有较高的催化能力，其最大反应速率（v max ）为742 µmol/（h·mg）。本研究所使用的PAD经克隆表达后，将其命名为LpPAD，经测定得到其对咖啡酸的v max 为57 540 µmol/（h·mg）。PAD催化咖啡酸脱羧可生成4-乙烯基邻苯二酚，在食品、高分子材料、生物医学及化工等领域具有广泛的应用前景。
四川农业大学食品学院的赵润棠、成玉和李琴*等人以植物乳植杆菌RS20D来源的PAD为研究对象，通过克隆表达获得重组PAD，即LpPAD。对该酶的酶学性质进行研究，同时进行分子动力学模拟及等温滴定量热（ITC）法分析，探究LpPAD对对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和芥子酸4 种底物的作用特性，以期为实现PAD的工业化应用提供一定的理论基础。
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克隆表达结果
以植物乳植杆菌RS20D基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得约546 bp的目的片段（图1A），并成功构建重组表达质粒pET-28a(＋)-RS20D，将重组质粒命名为LpPAD。如图1B所示，该重组质粒经BamHI与XhoI双酶切后产生2 条清晰条带，大小分别为546 bp与5 300 bp， 分别对应于目标插入片段及线性化的载体片段，与理论预期相符。DNA测序结果进一步证实目的基因已准确克隆至多克隆位点，序列完全正确，未发生任何碱基突变或移码。该基因编码182 个氨基酸，理论蛋白质分子质量为20.02 kDa。质粒质量检测表明其纯度符合蛋白表达要求。SDS-PAGE分析（图1C）显示，该重组质粒在宿主中成功表达出约20 kDa的蛋白条带，与预测分子质量一致，其中粗酶液与纯化酶液均可见相应目标条带，表明重组蛋白获得有效表达。
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LpPAD的酶学性质
2.1 pH值及温度对LpPAD活力的影响
对重组酶LpPAD的酶学性质进行表征。如图2所示，该酶的最适pH值为6.0，最适温度为35 ℃。在温度稳定性方面，LpPAD在30～45 ℃范围内表现出较高的热稳定性，且在35 ℃时稳定性最高。在pH值稳定性方面，LpPAD在pH 3.0～5.0区间内活性较低且稳定性较差；在pH 5.0～7.5区间内则表现出较高的活性及良好的稳定性，并于pH 5.5时达到稳定性峰值。当pH值升至8.0～10.0时，其稳定性呈逐渐下降趋势。
2.2 金属离子及化学试剂对LpPAD活力的影响
如图3所示，不同金属离子及化学试剂对重组酶LpPAD的活性影响显著。在1、5 mmol/L浓度条件下，K+、Cu2+、Zn2+和Ca2+均对LpPAD表现出激活效应，其中Ca2+的激活作用最强。相反，化学试剂EDTA、SDS及TX-100则对LpPAD呈现抑制作用，其中TX-100的抑制作用最为显著。当TX-100浓度为5 mmol/L时，其抑制效果最好，LpPAD相对酶活性约为60%。
2.3 LpPAD的底物特异性及酶促动力学参数
如表1所示，LpPAD对对香豆酸、阿魏酸、芥子酸的比活力与咖啡酸比活力的比值分别为0.949 6、0.116 4、0.070 9，可知LpPAD对咖啡酸的脱羧能力最强，而对对香豆酸、阿魏酸和芥子酸的脱羧能力依次减弱。LpPAD对各底物的动力学参数如表2所示，其对咖啡酸的vmax为959 IU/mg，明显高于其他底物，具有最高的反应速率；Km为3.90 mmol/L，高于对香豆酸和阿魏酸，表明LpPAD与咖啡酸的基态结合亲和力相对较弱，这可能与其邻二酚结构在LpPAD活性中心内的空间位阻或非最优结合取向有关。然而，咖啡酸的kcat/Km为16.68 L/（mmol·s），高于其他3 种酚酸底物，表明该酶对咖啡酸具有最高的催化效率。可能是咖啡酸的结构恰好与LpPAD的催化中心形成互补，能够极大地稳定反应过渡态，从而驱动了极高的催化速率。
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分子对接及分子动力学模拟
分子对接和分子动力学模拟对于理解蛋白质的构象变化和动态机制至关重要，且经常用于药物设计，是当前研究蛋白质与配体相互作用机制最成熟的手段之一。目前，分子动力学已被越来越多地应用于食品蛋白质相互作用研究。在PAD与酚酸的催化机制研究中，分子动力学技术发挥着重要的作用。Parada-Fabián等通过分子动力学优化模型并结合盲对接分析发现，优化后的模型显著提高了植物乳植杆菌及相关细菌PAD的底物结合效率和特异性，并证实底物结合腔内带电残基的变异是决定其底物特异性的关键，其作用机制在于影响了关键的氢键相互作用。陈阴竹等通过C端替换改造PAD，发现BJ6PAD-C1/BJ6PAD-C2突变体对咖啡酸的催化活性提升20%以上，对芥子酸的催化效率倍增，利用分子动力学探究其催化机制，发现C端替换通过拓宽底物通道增强疏水作用，从而提升催化性能。
通过分子对接技术，以LpPAD为受体，咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸和芥子酸为配体，采用AutoDock Vina软件进行模拟计算，经能量最小化优化后，分析获得关键结合构象。如图4所示，LpPAD与酚酸底物的相互作用网络及LpPAD活性中心微环境主要包括氢键、范德华力、π-π堆积及π-烷基作用等。LpPAD与咖啡酸通过Pro（A:155）主链羰基形成常规氢键，其羧基和酚羟基精准匹配LpPAD活性中心的氢键供体和受体，同时与Gly（A:47）间存在范德华力，并与Lys（A:157）产生π-烷基作用，这种多重相互作用稳定了酶-底物复合物。LpPAD与对香豆酸主要通过Tyr（A:168）和Val（A:150）的π-烷基作用及π-π T型堆积实现结合，芳香环空间效应对结合亲和力影响显著，但氢键作用较弱。LpPAD与阿魏酸通过Asn（A:147）、Ile（A:163）形成氢键网络，并与Tyr（A:168）发生静电吸引，但侧链甲氧基干扰氢键匹配。LpPAD与芥子酸通过Gln（A:109）的氢键及Pro（A:72）的π-烷基作用结合，双甲氧基破坏氢键网络完整性。相比于其他底物，咖啡酸与酶的相互作用多样且适配，能够更高效地稳定酶-底物复合物，促进底物结合和过渡态形成，这可能是其高效催化的重要分子机制。
为探究LpPAD对不同底物的催化特性，首先借助分子对接技术筛选出各底物与酶的最优结合构象；随后利用可视化软件将对接所得蛋白-配体复合物进行静态结构渲染，呈现出二级结构配体空间位置等信息。温度因子（B因子）反映了模拟过程中原子的热运动程度，体现了蛋白质结构的整体柔性，并将其在三维结构中进行可视化。如图5所示，LpPAD与咖啡酸结合后，酶活性中心及其关键催化微环境区域中呈现深蓝色的部分最多且整体形状变化最小，表明其B因子显著低于其他酶-底物复合物体系。较低的B因子意味着该区域氨基酸残基的原子波动性减弱，这种增强的结构稳定性有利于将酶构象锁定在更接近催化反应过渡态的状态。依据分子对接结果（图4），咖啡酸分子结构中的邻位酚羟基与其结合口袋内的残基形成了特异性的氢键网络，可能约束了LpPAD活性中心关键基团的运动自由度，这种受限的动态性使催化基团在反应过程中能更精确地定向，并维持最优的质子转移距离，从而显著提高催化效率。
如图6A所示，均方根偏差（RMSD）分析表明LpPAD-咖啡酸复合物在模拟后期构象稳定性最优，波动幅度最小；而LpPAD与对香豆酸、阿魏酸和芥子酸复合物的构象稳定性依次降低。LpPAD-咖啡酸复合物的高度稳定性为催化反应提供了持续且可重复的活性中心环境，有效避免构象紊乱导致的催化效率损失。如图6B所示，LpPAD-咖啡酸复合物形成丰富且动态稳定的氢键网络，在0～100 ns内保持较高氢键数量且波动较小。这种氢键网络能够增强底物结合稳定性，维持酶-底物复合物的活性状态；还能精准锚定底物反应官能团，诱导电子云重排，稳定催化过渡态，加速化学键转化过程。相比之下，其他3 种酶-底物复合物氢键数量少且波动大，导致结合稳定性差、催化导向性弱，从而限制了底物转化效率的提升。
如图7A所示，均方根波动（RMSF）分析表明，LpPAD-咖啡酸复合物在活性中心关键残基的波动更为平缓，表明其柔性适配性更优；该特性既保持了稳定过渡态所需的刚性，又通过合理的残基运动促进催化循环，从而使酶能快速达到最大反应速率。相比之下，LpPAD与对香豆酸和芥子酸的复合物在活性区域的RMSF过高，柔性过强可能导致催化基团定位不准；而LpPAD-阿魏酸复合物在活性中心处RMSF过低，刚性过强则可能限制了底物进出，均降低了催化效率。
如图7B所示，LpPAD-咖啡酸复合物的Rg在整个模拟过程中保持稳定且处于合理范围，表明酶蛋白折叠状态良好，整体结构紧凑性适配催化需求。这种结构完整性确保了酶活性中心空间布局的精准性，有利于加速底物转化。其他酶-底物复合物的Rg波动较大，可能破坏了酶活性中心的微环境，因而难以达到咖啡酸所对应的高催化活性水平。
如图7C所示，LpPAD-咖啡酸复合物在底物结合关键阶段（如初始结合、过渡态形成），其活性中心区域的SASA会适度降低，这表明，咖啡酸作为底物能与酶活性位点通过疏水作用、氢键等方式发生特异性结合，进而被有效容纳，提高结合亲和力。而其他底物则无法实现类似的有效结合，反而可能限制溶剂分子的进入，干扰催化过程，使酶的催化效率下降。
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ITC分析
ITC是一种通过实时监测滴定过程中的热量变化直接量化分子相互作用热力学参数，包括结合亲和力、化学计量比、ΔH、ΔS的生物物理技术。ITC技术单独或作为其他技术的补偿手段已被广泛应用于很多研究学科前沿，如纳米软材料科学、药物的传输、聚合物表面活性剂的相互作用等相关领域。近年来，其多领域应用价值日渐凸显，如Balmori等通过将ITC与纳瓦级差示扫描量热技术联用，揭示多孔纳米颗粒的孔径尺寸通过调控蛋白质构象变化、利用ITC检测的熵驱动吸附与放热稳定过程和热稳定性主导蛋白质电晕的形成机制，其中孔径大于蛋白质尺寸时，能形成孔隙内高稳定电晕。Winiewska等通过对比微量热泳动（MST）与ITC技术，揭示疏水性配体的纳米聚集现象会导致ITC测得的结合亲和力被系统性低估，而反向ITC或MST技术可规避此偏差。
如表3所示，LpPAD的底物转化速率差异主要源于底物结构调控的结合熵变与变构效应。相较于其他3 种底物，LpPAD与咖啡酸的反应具有最小的Kd和最高的结合稳定性，以及最大的ΔS，表明LpPAD与咖啡酸反应时具有最显著的熵增效应，分子混乱度增加最多，反应速率最快；n最大反映LpPAD与咖啡酸结合时表现出最强的正协同性，表明LpPAD上第1个位点结合咖啡酸小分子后，极大促进后续位点对同种分子的结合，使该反应具有最高的底物转化速率。可能是由于酶与咖啡酸中的3,4-二羟基结构通过氢键稳定脱羧醌式中间体，同时驱动疏水作用释放结合水并触发多亚基变构激活。而其他3 种酚酸底物与LpPAD酶促反应的疏水熵增值和n均低于咖啡酸，表明LpPAD对3 种酚酸的底物转化速率次之。该结果表明，酶的高效催化依赖于底物诱导的熵驱动脱水效应与协同性变构传导，苯环取代基类型通过微调水合层动态及亚基通讯深刻影响反应动力学。
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本研究成功从植物乳植杆菌RS20D中克隆并异源表达了LpPAD。系统的酶学表征结果表明，LpPAD对4 种酚酸底物的催化效能存在显著差异，其中LpPAD对咖啡酸表现出显著的催化偏好性，呈现最高的比活力与催化效率。为深入解析该特异性催化行为的结构基础与能量规律，整合分子动力学模拟与ITC分析，从酶构象动态与结合热力学2 个层面系统阐释了LpPAD高效催化咖啡酸的分子机制。
分子对接结果表明，咖啡酸苯环上的3,4-邻二酚羟基是其高效结合的关键功能基团，该结构能够与活性腔内的Gly47、Pro155和Lys157等关键残基形成包括氢键和 π-烷基作用在内的协同相互作用网络。相较于对香豆酸的单一酚羟基、阿魏酸与芥子酸的甲氧基取代基，咖啡酸的邻二酚羟基结构实现了与结合口袋更高程度的几何与电子云互补，从而将其稳定固定于最优催化取向，为后续脱羧反应奠定结构基础。分子动力学模拟揭示了催化过程中酶构象的动态演变规律。RMSD轨迹分析结果显示，LpPAD-咖啡酸复合物在整个模拟时间内RMSD最小，构象波动最为平缓，表明咖啡酸的结合诱导酶形成结构均一且有利于催化的形态。进一步通过RMSF分析发现，在咖啡酸作为底物时，LpPAD活性中心关键残基的波动幅度得到有效抑制，呈现出刚性支撑下的适度柔性特征。该特性既保障了过渡态稳定化所必需的结构刚性，又维持了催化循环中构象重排所需的动态适应性。此外，持续稳定的氢键数量、紧凑的分子Rg及适时发生的疏水包埋效应共同确保了咖啡酸在LpPAD活性位点中保持高反应性构象，从而直接转化为其最高的催化效率。分子对接及分子动力学模拟共同显示，LpPAD对咖啡酸的特异性识别依赖于其活性中心与底物结构的精密互补。
ITC分析结果从能量角度为上述发现提供了热力学证据。LpPAD与咖啡酸的结合呈现最小的Kd，证实其具有最强的结合亲和力与复合物稳定性，并且在该过程中表现出典型的熵驱动特征与极高的正协同性。这表明咖啡酸的结合在诱导酶构象稳定的同时，可能通过释放结合水分子及优化蛋白质内部运动熵显著增大体系混乱度，从而提供主要的结合驱动力。同时，极高的n强烈提示LpPAD可能以多聚体形式发挥功能，首个咖啡酸分子的结合引发了显著的变构激活效应，极大促进了后续底物分子的结合，从而实现协同增效的催化动力学。相比之下，其他酚酸底物或因甲氧基的空间位阻效应，或因相互作用模式单一，均未能引发同等程度的熵增与协同响应，导致其催化效率显著降低。ITC结果表明，结合过程的热力学与协同效应是高效催化的内在驱动力。
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结论
综上表明，LpPAD对咖啡酸的特异性催化是一个由精密的结构识别、优化的构象动态与有利的热力学协同共同调控的多维过程。在结构层面，咖啡酸独特的3,4-邻二酚羟基是其高效结合的关键功能基团，能够与活性腔内的Gly47、Pro155和Lys157等残基形成包括氢键和π-烷基作用在内的协同相互作用网络，实现与结合口袋的几何与电子云高度互补，从而将底物稳定于最优催化取向。分子动力学模拟进一步揭示了该结合模式对酶构象动态的影响：与咖啡酸复合后，LpPAD呈现最小的RMSD波动和紧凑的分子Rg，活性中心关键残基的柔性被有效抑制，形成一种“刚性支撑下的适度柔性”状态，这种构象特征既保障了过渡态稳定化所需的结构刚性，又为催化循环中的构象重排保留了必要的动态适应性。热力学层面，ITC分析证实LpPAD与咖啡酸结合时具有最小的Kd，表现出典型的熵驱动特征与极高的正协同性，提示咖啡酸的结合可能通过释放结合水分子及优化蛋白质内部运动熵显著增大体系混乱度，同时首个底物分子的结合引发变构激活效应，极大促进了后续底物的结合。相比之下，其他酚酸底物或因甲氧基的空间位阻效应，或因相互作用模式单一，均未能引发同等程度的熵增与协同响应，导致催化效率显著降低。综上，本研究从多尺度整合视角揭示了LpPAD偏好性催化咖啡酸的构效关系与能量机制，不仅深化了对PAD催化原理的认知，也为通过理性设计改造酶底物特异性、开发高效合成4-乙烯基邻苯二酚的工业生物催化剂奠定了理论基础。
引文格式：
赵润棠, 成玉, 胡子寒, 等. 植物乳植杆菌RS20D源酚酸脱羧酶LpPAD催化咖啡酸的表征及分子动力学模拟[J]. 食品科学, 2026, 47(13): 153-163. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251027-198.
ZHAO Runtang, CHENG Yu, HU Zihan, et al. Characterization and molecular dynamics simulation of LpPAD, a caffeic acid-specific phenolic acid decarboxylase from Lactiplantibacillus plantarum RS20D[J]. Food Science, 2026, 47(13): 153-163. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251027-198.
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实习编辑：李帆；编辑：阎一鸣；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
为进一步促进动物源食品科学理论的完善与创新，加速科研成果向实际生产力的转化，助力产业实现高质量、可持续发展，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、中国食品杂志社与海南大学、海南热带海洋学院、江西农业大学共同举办的“2026年动物源食品科学与人类健康研讨会”，将于2026年11月14-15日（11月13日报到）在中国 海南 海口召开。
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