《中国渔业统计年鉴2023》中显示，2022年我国鲢鱼淡水养殖产量为387.9万 t，仅次于草鱼，位居第2，是淡水鱼糜制品的主要原料鱼。通常工业化生产1 t鱼糜会产生25～40 t含蛋白质的废水，对鲢鱼糜漂洗废水中肌浆蛋白进行回收利用有助于实现鱼糜生物质废料的高值化利用和废水减排的双赢局面，将产生良好的经济价值和环境效益。
集美大学海洋与食品生物工程学院的任中阳、龙斯宇、黄琪琳*等通过冷冻干燥法、热处理法、等电点沉淀法、酸偏移法、壳聚糖絮凝法和酸偏移耦合壳聚糖絮凝法回收得到鲢鱼肌浆蛋白，对6 种回收肌浆蛋白的结构、分子质量、构象和功能特性进行表征并比较分析，以进一步了解肌浆蛋白在不同回收方式下的结构和功能特性变化规律，为更好地开发利用鲢鱼肌浆蛋白提供数据支持和理论依据。
1 回收方式对鲢鱼肌浆蛋白基本营养成分的影响
由表1可知，与CP、PP、IPP、FP相比，PCP所含蛋白质量分数为78.01%，低于HP（83.33%）。而CP总糖含量明显高于其他5 种方式回收的肌浆蛋白，这可能是由于提取过程中使用壳聚糖，蛋白质与壳聚糖进行电荷中和、桥连作用和静电相互作用而聚集沉降 ，增加了总糖含量；PCP中总糖含量低于CP，主要归因于酸偏移耦合壳聚糖回收方式中的壳聚糖添加量小于单一壳聚糖絮凝中壳聚糖的添加量。HP的脂肪含量最低，更利于贮藏；与HP相比，IPP、PP、PCP中灰分含量较高，说明提取过程中pH值调节导致盐离子增多，进而使灰分含量部分增加。
2 回收方式对鲢鱼肌浆蛋白氨基酸含量的影响
由表2可知，6 种提取方式的肌浆蛋白均含有所测得的16 种氨基酸，除CP之外，其余5 种提取方式回收的肌浆蛋白所含必需氨基酸含量丰富，在总氨基酸中的占比为41.25%～42.69%，均符合联合国粮农组织/世界卫生组织的理想模式推荐的比例（必需氨基酸/总氨基酸比值为40%），是理想的优质蛋白。CP的总氨基酸质量分数仅为51.52%，这可能是因为当溶液pH值较低时，蛋白带正电，而壳聚糖的氨基在酸性溶液中质子化使壳聚糖带正电，二者的静电排斥效应赋予系统相对动态稳定性 ，从而导致回收率较低。
3 回收方式对鲢鱼肌浆蛋白总巯基含量的影响
巯基是蛋白质中大量活性功能基团的重要组成部分，它具有较强的反应活性，对于蛋白质的功能特性发挥着重要作用。温度、pH值和溶剂类型的变化都会导致巯基氧化生成二硫键，因此巯基含量低说明形成的二硫键多，即蛋白质之间形成了交联。由图1可知，FP的总巯基含量最高（32.43 mol/105 g），IPP的总巯基含量（8.87 mol/105 g）次之，HP的总巯基含量（3.13 mol/105 g）最低，表明pH值变化、热处理、壳聚糖絮凝均会导致肌浆蛋白的巯基向二硫键发生不同程度的转化。冷冻干燥法有利于肌浆蛋白中巯基的保留，而酸和热处理有利于二硫键的生成。有研究表明，在酸性和碱性条件下，巯基易被氧化成二硫键，并且随着pH值逐渐降低或升高，巯基更易被氧化，即使pH值调回中性后，巯基含量仍会显著下降。此外，研究人员还发现，经过热处理后鲫鱼水溶性蛋白中的肌酸激酶和3-甘油醛-3磷酸脱氢酶之间形成二硫键。
4 不同回收方式鲢鱼肌浆蛋白的FTIR图谱
由图2可知，对于肌浆蛋白样品3 200～3 600 cm -1 范围内强而宽的吸收峰归属于分子间氢键伸缩振动；2 925 cm -1 处的弱吸收峰归属于C—H伸缩振动；1 650、1 536、1 395、1 230 cm -1 处吸收峰分别归属于蛋白酰胺I带（80% C＝O伸展和10% C—N伸展，接近1 650 cm -1 ）、酰胺II带（60% N—H弯曲、30% C—N伸展和10% C—C伸展，接近1 551 cm -1 ）和酰胺III带（40% C—N拉伸、30% N—H弯曲，接近1 300 cm -1 ）。肌浆蛋白样品的3 413、3 283 cm -1 和2 925、2 855 cm -1 处吸收峰分别归属于O—H和C—H的拉伸。
酰胺I带吸收峰所在的位置及其强度可以提供蛋白质二级结构的信息：1 600～1 640、1 640～1 650、1 650～1 660、1 660～1 700 cm-1的条带分别存在
-折叠、无规卷曲、-螺旋和-转角 。由图3可知：不同回收方式肌浆蛋白具有不同二级结构相对含量，PP的-螺旋相对含量最少，体系pH值的变化会改变蛋白质表面带电氨基酸、-羰基和-氨基末端质子化状态，促使蛋白质分子展开，这可能是导致肌浆蛋白二级结构由有序向无序转化的主要原因 ；HP的-折叠相对含量最高，加热促使蛋白变性，破坏了氢键和静电相互作用这些非共价键相互作用，导致-折叠的相对含量降低，并同时使-转角的相对含量升高；IPP的无规卷曲相对含量最高，表明pH值变化有助于无规卷曲形成；FP的-转角和-折叠相对含量相当，CP的-螺旋和无规卷曲相对含量相当，PCP的-转角、无规卷曲和-折叠相对含量相当，这些不同的现象可能是由于二级结构取决于许多因素，包括主要二级结构类型、蛋白质性质、变性程度、聚集状态和回收条件等 。
5 不同回收方式鲢鱼肌浆蛋白的色氨酸荧光光谱
色氨酸荧光发射光谱能够灵敏反映蛋白质的构象和微环境的极性是否发生改变。由图4可知，不同回收方式肌浆蛋白的荧光强度从大到小依次为FP、IPP、PP、CP、PCP、HP。不同回收方式肌浆蛋白的最大吸收波长（
max ）从大到小依次为HP、IPP、CP、PP、FP、PCP。酸偏移耦合壳聚糖絮凝法和热处理对肌浆蛋白的色氨酸内源荧光光谱强度影响较其他回收方式较大。
色氨酸内源荧光光谱中
max 红移代表蛋白质中色氨酸残基微环境极性增强。热处理会导致蛋白质空间结构的剧烈变化，在加热过程中，肽链逐渐伸展，色氨酸残基逐渐暴露在分子外部的极性环境内，蛋白质的内源荧光强度逐渐降低，产生荧光猝灭现象，max 红移，这可能是HPmax 较大和荧光强度较小的原因。吴晓娟等推断，米糠蛋白的max 随酸偏移处理时间的延长而出现先红移再蓝移的原因为疏水相互作用使已暴露的疏水基团重新聚集，从而使色氨酸残基体系的非极性增强，这可能也是PCPmax 较小的原因。PCP的max 和荧光强度明显小于CP和PP，因此酸偏移和壳聚糖复合处理对肌浆蛋白荧光光谱的影响比酸偏移、壳聚糖絮凝单独作用时的影响更大。6 回收方式对鲢鱼肌浆蛋白分子质量分布的影响
SDS-PAGE是反映蛋白质分子质量变化的最直观且便捷的方法之一，用于蛋白质的亚基分子质量分析。鲢鱼水溶性蛋白质的分子质量主要为30～97 kDa，由图5可知，仅有CP在70 kDa以上仍有多条较明显的条带，表明壳聚糖能与肌浆蛋白结合，絮凝出更大分子质量的肌浆蛋白。PP、PCP和HP的35～40 kDa处条带消失，归因于肌浆蛋白在酸或热处理条件下的变性及溶解度的下降。未溶解的蛋白质成为电泳样品离心后剩下的沉淀，不能进入电泳条带，所以一部分电泳条带的灰度会因为蛋白质的变性程度大而较浅，甚至可能不出现。PP和PCP在10～15 kDa处的条带颜色较深，归因于部分蛋白解聚产生小分子质量肽链。PCP的40 kDa处的条带较PP颜色深，这可能是因为壳聚糖和肌浆蛋白分子结合，从而使蛋白质亚基分子质量增加并上移至40 kDa，也可能是由于PP在40 kDa处的溶解性较低。
7 回收方式对鲢鱼肌浆蛋白表面疏水性的影响
蛋白质的表面疏水作用与其溶解性、乳化能力及乳化稳定性之间具有密切关系。由图6可知，不同回收方式肌浆蛋白的表面疏水性从大到小依次为HP、PCP、CP、PP、IPP、FP，分别为1 366.75、1 224.56、1 072.41、831.69、779.16和402.97，酸偏移、热处理和壳聚糖絮凝对肌浆蛋白表面疏水性的影响较大。
pH值变化使鲢鱼肌浆蛋白分子伸展，导致蛋白质的三级结构变化和疏水基团暴露，蛋白质的表面疏水性增加，这可能是因为酸处理时使用的盐酸溶液中阴离子Cl-能使蛋白质溶液发生促溶效应，使蛋白质在盐酸溶液的酸性环境中更易变性。研究发现，鲢鱼肌肉中的水溶性蛋白质在加热到40 ℃时，蛋白质基团如非极性氨基酸开始暴露，其表面疏水性开始增加，在70 ℃时达到最大值，与本研究中HP的表面疏水性最大结果相符。
壳聚糖可以使鲢鱼肌浆蛋白结构展开，疏水基团暴露，从而与ANS探针结合，使其表面疏水性增加。壳聚糖的添加可以提高蛋白质的疏水相互作用，但是当多糖的添加量过大时，蛋白质的疏水性反而可能降低。这可能是因为蛋白-多糖体系的黏度随着多糖含量的增加而增加，导致展开的蛋白结构又被包裹在复合体系中，从而导致体系的疏水相互作用减弱。
8 回收方式对鲢鱼肌浆蛋白溶解性的影响
由图7可知，FP的溶解性最高，为64.66%，IPP和CP溶解性分别为16.91%和15.25%，PP、PCP、HP的溶解性较低，分别为4.64%、3.41%和3.16%，且差异不显著。冷冻干燥会使肌浆蛋白的结构发生变化，使其与水分子的相互作用减少，溶解性降低 。Krasaechol等 报道金线鱼冻干肌浆蛋白的溶解度约为45%，Kim等 报道岩鱼冻干肌浆蛋白的溶解度约为60%。热处理、pH值变化及壳聚糖絮凝都会导致肌浆蛋白的结构改变，从而导致其溶解性下降，其中酸偏移和热处理对肌浆蛋白溶解性的影响相比其他回收方式较大。归因于PP和PCP都是通过调节pH值到3再到7进行沉淀，导致PP和PCP在pH 7.0的磷酸盐溶液中溶解性较低。You Juan等 也发现，加热的鲢鱼肌浆蛋白在pH 4.0～9.0时溶解性显著低于未加热组。
9 回收方式对鲢鱼肌浆蛋白起泡性的影响
由图8可知：FP的起泡性最高，为56.67%；IPP和CP的起泡性次之，分别为30%和28.33%，二者差异不显著；PP的起泡性为12.22%，PCP和HP的起泡性最低，仅为3.67%和2.56%。蛋白质的起泡性与溶解性有直接关系，溶解性最高的FP起泡性最好，而溶解性最低的PCP和HP起泡性也最差。热处理、pH值变化和壳聚糖絮凝都可以引起肌浆蛋白的结构改变，从而导致起泡性下降，其中酸偏移和热处理对肌浆蛋白起泡性的影响比其他回收方式更大，前者归因于蛋白质水解引起的蛋白质分子质量和溶剂黏度降低 ；后者归因于HP的结构变化，特别是表面疏水性增加（图6）。酸偏移耦合壳聚糖絮凝促使PCP的表面疏水性增加，降低了其起泡性能，明显低于PP和CP。
10 回收方式对鲢鱼肌浆蛋白乳化性和乳化稳定性的影响
由图9可知，经壳聚糖絮凝后冷冻干燥得到的CP的EAI大于直接冷冻干燥得到的FP的EAI，表明壳聚糖有利于肌浆蛋白乳化性的改善，归因于肌浆蛋白与壳聚糖发生相互作用，二者的复合物表面电荷增加，导致肌浆蛋白的乳化性增强。IPP和FP的EAI无显著差异，分别为6.56、6.63 m2/g，表明等电点沉淀法对肌浆蛋白的EAI影响较小，但会不利于肌浆蛋白的乳化稳定性，这一结果与Yongsawatdigul等的研究结果相近。HP、PP、PCP的EAI较低且无显著差异。IPP的ESI显著低于其他组，但由于PCP、PP及HP的EAI均较小，而ESI是由乳液10 min后吸光度和初始吸光度的比值表示，以致其细微的变化均会导致肌浆蛋白的ESI产生较大的变化。
结论
不同回收方式下鲢鱼肌浆蛋白的结构和功能特性不同。FP的总巯基含量、色氨酸内源荧光强度、溶解性、起泡性较大，而PP和HP的总巯基含量、色氨酸内源荧光强度、溶解性、起泡性较小。不同回收方式肌浆蛋白的二级结构含量不同，HP、FP的
-折叠相对含量较高，IPP、PP的无规卷曲相对含量较高，CP的-转角相对含量较高，所有回收肌浆蛋白的-螺旋相对含量都较小，表明肌浆蛋白二级结构由有序向无序不同程度转化。SDS-PAGE结果表明，CP含有大分子质量复合物，而PP会使部分蛋白解聚。CP乳化性最好，IPP对肌浆蛋白的EAI影响较小，但对肌浆蛋白的ESI影响较大，PCP的EAI低于CP。本研究揭示了鲢鱼肌浆蛋白在不同回收方式下的结构和功能特性变化规律，对改善肌浆蛋白的功能特性和拓宽其在食品工业的应用范围具有指导意义。本文《鲢鱼糜漂洗液中不同回收方式肌浆蛋白的结构和功能特性 》来源于 《食品科学》2024年45卷第 7 期225 - 232 页，作者：任中阳，龙斯宇，康宁哲，石林凡，翁武银，黄琪琳 。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20230728-304 。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
作者简介
通信作者：
黄琪琳，女，博士，华中农业大学食品科技学院教授/博士生导师。国家科技专家库专家、科技部和教育部科研项目和科技奖励评审专家、国家自然科学基金网评专家、湖北省科技厅专家库专家、湖北省创新能力建设专家库专家、中国食品卫生安全教育专业委员会委员、Journal of Aquaculture and Research、Green and Sustainable Chemistry和华中农业大学学报编委。
长期致力于食品大分子（多糖和蛋白）的多级结构、功能特性及组分相互作用；水产品加工保鲜、品质改良及副产物综合利用方面的研究。近五年，主持国家自然科学基金（2项）、人才项目（2项）、国家重点研发项目子课题、中央高校科研专项、高校博士点基金、省科技创新及成果转化项目、市应用基础研究项目、教育部和省重点实验室课题、上市企业技术研发项目等近20项。以通信/第一作者在 Bioresource Technology、Food Hydrocolloids、Carbohydrate Polymers、Ultrasonics Sonochemistry、Food Chemistry、《食品科学 》、 《中国食品学报 》、 《现代食品科技 》、 《水产学报 》等国内外主流刊物上发表论文98篇，其中SCI 69篇（JCR1区TOP期刊60篇，22 篇IF>10.0，均篇IF>8.0，累计IF=578），2 篇SCI论文入选1‰ESI高被引论文，1 篇SCI论文入选热点论文，EI 59 篇；省科技成果鉴定7 项，授权国家发明专利7 件。获教育部2022年科技进步二等奖，先后入选闽江学者讲座教授、十百千人才工程和青年科技晨光计划。
第一作者：
任中阳，男，工学博士，集美大学海洋食品与生物工程学院副教授，硕士生导师，福建省高层次人才，福建省科技特派员。曾在新加坡国立大学访学。主要从事食品科学领域的科研与教学工作。主要专注于利用生物大分子构建功能性成分的乳液递送体系及其在水产品加工中的开发应用、水产副产物的高值化利用。近年来，在国内外 Food Hydrocolloids、Food Chemistry、LWT-Food Science and Technology、Food Research International、International Journal of Biological macromolecules、 《食品科学 》、《食品工业科技 》等食品类主流平期刊发表学术论文30余篇，其中发表SCI学术论文20余篇，ESI高被引论文2 篇。申请发明专利10余项。曾指导学生获得福建省互联网+大学生创新创业大赛金奖、全国大学生生命科学竞赛（创新创业类）二等奖等。参与省部级《“禁塑令”下的蛋白基可食膜制备虚拟仿真实验》和福建省一流本科线下课程《水产品加工工艺学》的建设工作。
实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
热门跟贴