编辑丨王多鱼
排版丨水成文
如果把细胞比作一个精密运转的 “微观宇宙”，那么超分辨显微镜就是帮助科学家绘制这片宇宙“星图”的关键工具。单分子定位显微镜（ SMLM ）因具备纳米级分子定位能力，已成为生命科学研究中的重要成像手段。然而，这类技术长期面临一个核心瓶颈：分辨率各向异性。也就是说，它在横向成像上足够清晰，但在轴向，也就是上下方向，分辨率通常比横向差 2–3 倍。对于许多具有复杂三维形态的细胞结构而言，这意味着它们往往难以被完整、准确地解析。
为突破这一限制，传统 4Pi-SMLM 技术利用两个相对放置的物镜进行干涉探测，大幅提升轴向定位精度，从而实现接近各向同性的三维成像。尽管性能出色，这一方案却长期受制于复杂的光路设计、极高的调试要求以及昂贵的硬件和维护成本，因此一直难以走出少数顶尖实验室。如何在保留 4Pi 高精度优势的同时，显著降低系统门槛，始终是该领域亟待解决的重要问题 。
2026 年 3 月 31 日，西湖大学生命科学学院章永登团队（ 博士生于紫荆、助理研究员郑贝博士为论文共同第一作者 ）在Nature Biotechnology期刊发表了题为：Mirror-enhanced 4Pi-SMLM with one objective enables isotropic nanoscale imaging 的研究论文。
该研究开发了一种新型超分辨显微技术：镜面增强 4Pi 单分子定位成像技术（me4Pi-SMLM）。该技术巧妙地用一面反射镜替代了传统 4Pi 系统中的第二个物镜，在大幅简化系统结构、降低硬件成本和维护难度的同时，实现了与传统双物镜 4Pi-SMLM 相当的高精度三维成像能力，为纳米尺度生物成像提供了一个更易用、更稳健的新平台。
me4Pi-SMLM的核心创新在于，将原本复杂的“双物镜干涉”架构，转化为更简洁的“单物镜 + 反射镜”设计（图1）。在这一系统中，激发光经物镜照射样品后，会被样品上方的反射镜再次反射回样品区域，从而在轴向形成可调控的干涉条纹。研究团队进一步利用快速压电促动器对反射镜进行毫秒级调节，连续采集不同相位下的图像。这个过程如同为分子定位增加了一把更精密的“立体标尺”，使系统能够更准确地解析单个荧光分子的三维空间坐标。正是这面看似简单的镜子，使系统的轴向定位精度提升了约 5 倍。
图1：me4Pi-SMLM原理与性能验证
为了验证技术性能，研究团队对微管、核孔复合物和内质网等典型亚细胞结构进行了成像（图2）。结果显示，me4Pi-SMLM 不仅能够清晰分辨微管的中空结构，还能够精准重建核孔复合物高度有序的双环排布，并解析内质网中细微而复杂的片层与管状网络，展现出优异的三维超分辨成像能力。
图2：me4Pi-SMLM解析亚细胞结构
在此基础上，研究团队进一步实现了双色成像，可同时观察不同细胞结构之间的空间关系。例如，在微管与内质网的双色成像中，两种结构边界清晰、互不混淆；在内质网膜与内质网腔的成像中，系统成功揭示了彼此紧邻的亚结构差异。这一能力使研究人员能够更直观地探究细胞器之间的相互作用与组织关系。针对较厚样本的成像需求，研究团队还在系统中引入了像散编码，实现了对更大深度范围内分子的准确定位。借助这一设计，研究人员在细胞全尺度上对联会复合体和线粒体网络进行了三维成像，在不同空间方向和不同深度上都获得了清晰结果。即使面对深度达 4.5 微米的全细胞样本，me4Pi-SMLM 依然保持了稳定的高精度定位能力，显示出优异的全细胞三维重建潜力。
更重要的是，me4Pi-SMLM 的应用并不局限于固定样品，还可进一步拓展到活细胞成像、三维单分子追踪以及厚组织成像等多个方向。在活细胞实验中，该技术实现了 40-60 纳米分辨率的三维动态观测；在单分子追踪中，达到了 6 纳米定位精度和 9 毫秒时间分辨率；在小鼠脑组织切片中，其三维分辨率依然优于 15 纳米，展现出良好的组织成像前景。
这项研究的重要意义，不仅在于“看得更清”，更在于“更容易用”。与传统 4Pi 系统相比，me4Pi-SMLM 显著降低了系统复杂度、维护难度和硬件成本，同时还具备良好的兼容性和升级潜力：现有 3D-SMLM 平台只需增加反射镜和压电促动器，就可以升级到 4Pi 级别的三维成像精度。该成果有望推动高精度三维超分辨成像从少数高门槛平台走向更广泛的生命科学研究场景，为细胞生物学、神经科学以及疾病机制研究提供新的观察工具。
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-026-03083-7
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