非洲猪瘟在我国爆发以来，对生猪产业造成了严重影响，特别是种猪资源面临群体灭绝严重威胁，迫切需要探寻一种更加完整、安全、高效的保种策略。本文在分析非洲猪瘟背景下种猪资源面临严峻形势的基础上，结合实际，提出在活体保种的基础上，同步开展猪精液冷冻保存、组织冷冻保存、体细胞冷冻保存三种保种策略，并对三种保种策略未来应用以案例形式进行了分析，以期为政府宏观决策和种猪资源养殖场开展生物保种提供依据和参考。
1 非洲猪瘟背景下种猪资源面临的严峻形势
我国地方猪种出现“土猪危机”
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染引起的猪的一种急性、热性、高度接触性烈性传染病。该病潜伏期长、隐蔽性强，传播速度极快，威胁性极高，自1921年在肯尼亚首次发现，已在全球多个国家爆发流行，部分国家呈现大暴发、大流行态势。自2018年8月初我国首次发现非洲猪瘟以来，截至2019年6月21日，全国31个省份发生非洲猪瘟疫情139起，当前我国非洲猪瘟疫情防控形势仍然十分严峻。在当前缺乏安全有效疫苗防治的形势下，猪场一旦发生非洲猪瘟疫情只能进行全群扑杀、隔离和封锁，对生猪产业造成损失极其严重，特别是对于国家生猪核心育种场、地方猪资源保种场、种公猪站以及其他高价值猪场，一旦感染非洲猪瘟疫情，极其可能导致群体灭绝，永久失去宝贵种质资源，损失不可估量。因此，面对非洲猪瘟的严峻形势，在做好生物安全措施的基础上，同步开展种猪资源精液冷冻、组织冷冻、细胞冷冻等已经商业化应用的生物保种策略，将是未来值得考虑的发展方向，作为活体保护的重要补充方式，对于应对非洲猪瘟疫情威胁，降低种猪资源灭绝风险具有重要现实意义和长远战略意义。
2 种猪资源生物保种技术
猪遗传资源现有保存方式
2.1 精液冷冻保存
精液冷冻保存指将离心浓缩、添加保护成分并经过适当降温平衡的猪精液置于液氮中进行长期保存。猪精液在冷冻保存前应对非洲猪瘟、猪瘟、猪伪狂犬、猪口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征等重大疫病进行检测，依据检测结果，借助精液冻存技术保存公猪精液，可以保证良种基因长时间保存，免受非洲猪瘟等疫病影响。国内百钧达、北京田园奥瑞等专业公司已相继研发出猪冻精保存技术和配套设施设备，广东温氏、上海祥欣、河南精旺等国内著名育种企业也已相继建立猪冷冻精液商业化生产平台并在全国范围开展商业化推广，河北省在全国率先制定了《猪冷冻精液》（DB13/T 2633-2017）地方标准。目前，猪冷冻精液解冻后活力可达到0.7以上，结合深部输精技术，配种母猪受胎率、产仔数等生产指标均可达到常温精液生产水平,已完全具备在全国范围推广应用条件。
2.2 组织冷冻保存
组织冷冻保存指将处理后的组织与冻存液按一定比例混匀后，按设定的降温速率降温，然后置于液氮长期保存。简言之，无菌采集健康猪耳组织，将组织剪碎后加入适量冻存液，经降温平衡置于-196℃液氮长期保存，待需要时复苏培养分离体细胞。该技术可以以极低的成本，快速保存任意日龄、任意性别的种猪资源组织即100%保存种猪资源个体基因，结合体细胞克隆技术，可以在将来任意时间快速恢复原有种猪资源群体，避免非洲猪瘟疫情造成灭群风险。目前，河南创源生物技术有限公司利用该技术冷冻组织可以达到接近100%的冻存复苏率，结合体细胞克隆技术，代孕母猪怀孕率达到80%以上，窝产仔数达到6-8头，窝断奶仔猪数达到5头左右，关键技术指标已经达到国内领先、世界一流水平，已具备在全国范围进行示范与推广的条件。
2.3 体细胞冷冻保存
体细胞冷冻保存指将体外分离培养的细胞与冻存液按一定比例混匀后，按设定的降温速率降温，然后置于液氮长期保存。简言之，无菌采集健康猪耳组织，将组织剪碎与细胞培养液混合，置于培养箱体外培养原代细胞或第1代细胞，将分离培养的细胞与适量冻存液混合，经降温平衡置于-196℃液氮长期保存，待需要时直接复苏培养即可。体细胞冷冻保存是最为常用的保种技术，该技术具备组织冷冻保存的的所有优点，即可以保存不同日龄、不同性别的种猪资源，结合体细胞克隆技术，可以随时快速恢复原有种猪资源群体，避免非洲猪瘟疫情造成灭群威胁，但保存成本较组织冷冻保存高3-5倍。目前，国内大部分高校、科研院所均已掌握该技术，并结合体细胞克隆技术成功获得克隆后代，河南省也于2014年获得体细胞克隆猪35头，填补了河南省无克隆动物出生的空白。
3 应用案例
3.1 精液冷冻保存
以国外引进种公猪、育种核心群种公猪为例，引进种公猪和育种核心群种公猪均为经过系统选育评估的优秀种公猪，如果单纯依靠鲜精人工授精，多余精液会造成极大浪费，且优秀种公猪本身价值也难以得到充分发挥，同时，种公猪利用期及鲜精辐射范围有限，也极易遭受非洲猪瘟等不可抗力因素威胁，不得不重新引种或花费相当大的代价重新培育新的优秀种公猪，得不偿失。因此，种猪场应该具备超前思维，依托专业化猪冻精服务公司尽快建立猪冷冻精液保存体系，对于引进优秀种公猪或育种核心群优秀种公猪及时开展健康评估，在保证鲜精正常使用的基础上，适时开展猪冷冻精液保存。待需要时，按照冻精解冻程序复苏冻存精液，结合深部输精技术，即可发挥优秀种公猪的基因价值。同时，还可以对外销售冻精，使优秀种公猪价值得到无限放大。
猪精子耐冻性
3.2 组织或细胞冷冻保存
以地方猪品种、濒危或濒临灭绝猪品种、其他高价值猪品种为例，众所周知，地方猪品种或其他高价值猪品种通常群体数量小，分布区域有限，但潜在价值难以衡量，这些珍贵的种猪资源如果遭受洪水、火灾、地质灾害、高致死性传染病（如非洲猪瘟）等不确定因素威胁，极有可能面临种群灭绝风险。对此，在做好常规活体保种的基础上，地方猪保种场应自建或联合高校、科研院所，适时采集保种场不同家系的公猪和母猪耳部组织，一部分经过处理直接冷冻保存，一部分经过分离培养冷冻保存体细胞，分散保存以备使用。待遭受突发因素条件成熟后，分别复苏冻存的公猪、母猪耳部组织或体细胞，结合体细胞克隆技术，可以快速恢复原有群体，是应对非洲猪瘟等突发情况威胁，丰富种猪资源保护手段，推动生猪产业可持续发展的重要途径。
4 展望
种猪种质资源是生物多样性的重要组成部分，也是生猪产业可持续发展的重要战略资源，对于确保食物有效供给和安全，推动畜牧业可持续发展具有不可估量的重要作用。在当前非洲猪瘟背景下，单纯依靠活体保种已不在是完整、安全、高效的保种策略。各级部门应该转变观念，适应形势，群策群力，加强顶层设计，健全法律法规，完善扶持政策，明确责任清单，全盘考虑、统一规划，探索建立原产地保护和异地保护相结合、活体保种和遗传材料保种相补充、主体库保存和备份库保存相配套、政府部门保护与保种场保护相衔接的种猪资源保种体系，以此增强规避风险，达到促进产业转型升级，推动产业健康可持续发展的战略目的。
（文/河南省畜牧总站 王献伟）
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