撰文 | 亦
近日，美国Broad研究所王潇团队在Nature Biotechnology上发表了文章Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA， 通过合成带具有多个合成polyA尾的mRNA来延长mRNA蛋白表达的持续时间并提高表达水平。
首先，文章在之前报道的方法 （使用T4 RNA连接酶I将化学合成的寡核苷酸（oligo）连接到体外转录mRNA的3′末端） 基础上发展了一套合成多尾mRNA的方法。具体而言，作者选取了合适的分支多聚A尾的合成策略，再通过筛选获取不能被水解的非自然分支连接，在对不同类型的寡核苷酸交联化学进行测试后，作者确定了铜催化叠氮-炔环加成反应 （CuAAC） ，并引入高效液相色谱进行分支RNAs的纯化。
分支mRNA的合成和筛选
接下来，文章解析了分支多聚A尾增强mRNA翻译能力的机制。作者将蛋白质翻译增强的总体影响分解为mRNA的稳定性 （半衰期t1/2） 和翻译效率 （TE） 两个因素，通过原位图谱分析 （STARmap和RIBOmap） ，对细胞膜mRNA进行准确定量。作者发现在24小时内，无论化学修饰和拓扑结构如何，TE的差异都不显著，这表明多聚 （A） 枝不会阻碍或增强TE。然而，48小时后，纯修饰 （mod-only） 和多尾mRNA的TE都高于模拟对照 （分别为1.53 ± 0.35和1.53 ± 0.38倍） ，72小时后，纯修饰mRNA的TE与对照相似 （1.02 ± 0. 27 倍） ，而多尾 mRNA的TE仍高出1.84 ± 0.44倍，这表明多尾mRNA在较后的时间点保留了功能更强的poly(A)尾部，以更好地维持帽子/尾巴依赖性翻译启动。类似地，多尾 mRNA进一步将t1/2增加到16.8±1.2小时，而内部 RLuc对照的衰减动力学保持不变，这证实了具有化学修饰和分支尾部的mRNA的活性翻译时间更长。作者发现，分支多尾polyA的化学修饰和拓扑结构都有助于其功能和稳定性。有趣的是，作者发现不同于经典的mRNA起始对eIF4E–eIF4G复合物的依赖，多尾mRNA利用eIF4–eIF3起始翻译。
mRNA的原位表征示意图
随后，作者在体内对多尾mRNA产生蛋白的能力进行了验证。发现在体内，分支多尾结构不会导致体内长期免疫毒性，同时能以低剂量实现高蛋白表达。RNA优化后的多尾mRNA在细胞内转染后24至72小时内产生的发光信号比对照mRNA高出约4.7-19.5倍，在体内可检测到信号的时间是对照组的两倍。于是作者对多尾mRNA作为功能基因组学和疗法应用的可能性进行了拓展，发现多尾mRNA能够增强基于mRNA的CRISPR–Cas9系统的编辑效率。如在小鼠肝脏的体内基因编辑中，多尾Cas9 mRNA的使用实现了Cas9蛋白在较低mRNA剂量下的有效表达，有效降低了总胆固醇含量。
综上，文章采用合成-有机-酶混合方法，开发出拓扑和化学修饰的多聚（A）尾mRNA，即多尾mRNA。提供了除线性、环形RNA外的另一种RNA拓扑结构，这种拓扑结构既能保留依赖于帽子的翻译启动，又能增加RNA的稳定性，从而提高单个RNA分子的整体翻译能力。经过修饰的分支聚 （A） 尾可以像天然线性聚 （A） 尾一样与PABPC1形成多聚物相互作用，而且化学和拓扑修饰都能有效保护聚 （A） 不被降解，从而延长蛋白质在体内的表达时间，同时不会增加免疫原性，并能以较低的mRNA剂量传递Cas9等功能性蛋白质。
参考文献
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https://www.nature.com/articles/s41587-024-02174-7
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