人乳低聚糖（HMOs）是母乳中仅次于乳糖和脂类的第三大营养成分，2’- 岩藻糖基乳糖（2'-FL)和 3- 岩藻糖基乳糖（3-FL)是具有代表性的HMOs。3-FL 是在泌乳期唯一含量稳定上升的 HMO，具有免疫调节、胃肠道保护等多种生理功能。通过代谢工程和合成生物学在微生物宿主中构建 3-FL 合成途径是现阶段的主流手段。而大多数微生物宿主如大肠杆菌和酿酒酵母，都具有一个完整的内源性 3-FL 生物合成途径，涉及多个酶的催化作用。其中，FutA 作为一个关键的限速因子，受到了极大的关注。
近期，江南大学沐万孟教授团队通过优化培养条件、灭活参与 3-FL 合成的竞争通路基因、整合筛选三种转运蛋白，并对关键限速酶进行定点饱和诱变，成功将 3-FL 滴度提升至 52.1 g/L。为提高微生物细胞工厂中 3-FL 的生物合成效率提供了更加有效的工程策略。目前，这项研究成果已经以“Combinatorial Optimization Strategies for 3‑Fucosyllactose Hyperproduction in Escherichia coli”为题发表在Journal of Agriculture and Food Chemistry上。
（来源：Journal of Agriculture and Food Chemistry）
首先，研究员通过先前研究构建的大肠杆菌 E07 优化 3-FL 的生物合成过程。经过基因编辑后大肠杆菌 E07 可生产 3-FL，并在 DM 培养基中添加 5 g/L 酵母提取物和 IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）后，3-FL 的产量从 2.21 g/L 增加至 3.60 g/L。然后再次经过基因编辑（沉默 wcaH 和 lon）得到菌株 BD1 和 BD2 中，在 GDP-focus 供应充足的情况下，3-FL 滴度增加至 3.82 和 4.12 g/L，这表明可能有其他因素影响 3-FL 的产量。
图 | 3-FL生物合成的工程代谢途径（来源：Journal of Agriculture and Food Chemistry）
接下来，研究员通过定向筛选提高 3-FL 生物合成。因为 3-FL 产量与细胞外分泌水平相关，所以研究员对 SetA、M2H 和 TP Y.b 等转运蛋白进行研究，发现其能有效促进 3-FL 分泌。特别是将 M2H 整合到大肠杆菌 BD2 后（命名为 BD3），其 3-FL 产量最高，提高了 1.2 倍，达到 4.8g/L。
随后研究员基于现有蛋白晶体结构和计算机辅助热点筛选，选择了 FutM2 进行定点饱和诱变。研究员们通过蛋白质工程，对 FutM2 的结构进行建模和突变分析，发现 126 位点为关键突变点，突变体 Q126A、I、V、S 可以显著提高 3-FL 产量。此外，基于 FutA 及其变体 M32 的生物信息学分析，对多种 FutM2 进行修饰，也显著提高了 3-FL 的合成性能。表明利用蛋白质工程技术提高 FutM2 性能是提升 3-FL 产量的有效策略。
最后，研究人员采用了两种发酵策略，通过分批补料发酵进行验证。第一种策略是间歇性添加甘油和乳糖，工程菌株 BD3-A 在 52 小时后 3-FL 滴度达到 41 g/L；第二种策略是继续优化发酵条件（如添加酵母提取物、调整 IPTG 添加时间等），53 小时后 3-FL 滴度提升至 52.1 g/L。
总的来说，本研究通过优化培养条件、灭活参与 3-FL 生物合成的竞争通路基因、并进行转运蛋白质的整合，来最大化增加胞外 3-FL 的产出。并且对 FutM2 的结构进行建模和突变分析，发现了关键突变点，以此获得最佳菌株 BD3-A。最后通过摇瓶和分批补料发酵使得 3-FL 的产量分别为 6.91 g/L 和 52.1 g/L，使其具有大规模工业应用的潜力。
这篇论文通讯作者沐万孟教授是江南大学食品科学与技术国家重点实验室、食品学院教授、博士生导师，国家优青、江苏省杰青、霍英东基金会青年教师奖获得者。主要从事食品酶与食品酶工程、食品功能配料生物制造等应用基础和产业化研究。主持国家自然基金（5 项）、国家重点研发项目和课题等项目 20 余项。近 5 年，发表 SCI 论文 150 余篇，获授权发明专利 40 项（含国际专利 2 项）；完成技术成果鉴定 4 项，获山东省科技一等奖、教育部科技进步二等奖等科技奖励。
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