摘要：病毒样颗粒（VLPs）是具有多种应用的纳米结构，包括治疗、免疫和诊断。随着生物医学工程技术的最新进展，商业化的基于VLP的疫苗正在被广泛用于抗击传染病，同时还有更多疫苗处于临床研究的不同阶段。由于它们在效果、安全性和多样性方面的期望特性，基于VLP的方法在未来几年可能会变得更加常见。然而，在基于VLP的方法能够广泛应用于治疗之前，必须解决一些生产和制造方面的挑战。这篇综述提供了对近期基于VLP疫苗开发情况的见解，重点介绍了它们的特性、表达系统以及作为理想候选者对抗新兴病毒病原体的潜在适用性。最后，详细阐述了基于VLP的疫苗作为可行且高效的免疫剂，诱导对包括SARS-CoV-2在内的病毒性传染病病原体以及基于蛋白质纳米颗粒的疫苗产生免疫的潜力。因此，VLP疫苗可能作为传统疫苗策略的有效替代品，用于抗击新兴的传染病。
1.引言
目前市场上的大多数疫苗主要基于灭活（杀死）或减毒活疫苗的方法。尽管这些传统疫苗已经有效地用于对抗各种传染病，但它们存在一些限制，包括较低的诱导更强免疫反应的潜力和较差的效力。最近传染病的爆发表明了开发强大疫苗以克服这些限制的需求。主要挑战在于开发新的技术方法，增强免疫力，同时不损害安全性、效力和耐受性。最近在DNA、mRNA和重组病毒载体疫苗方面的进展为针对难以靶向的病原体和控制传染病爆发的有效疫苗开发方法。
病毒样颗粒（VLP）技术为开发有效疫苗以抗击严重关注的传染病提供了一个替代平台，并且它与mRNA和病毒载体疫苗并行发展。与其他亚单位疫苗相比，VLPs在免疫原性方面也更强，因为它们在表面以更真实的确认形式呈现重复的抗原表位，免疫系统可以容易地检测到。另一方面，亚单位疫苗由于目标抗原的错误折叠或对免疫系统的呈现不足而具有较差的免疫原性。此外，它们需要佐剂和多次疫苗接种才能引发足够的免疫反应。Fraenkel-Conrat和Williams（1955年）首次通过从纯化的RNA和蛋白质组分重新组装烟草花叶病毒（TMV）颗粒来描述病毒样颗粒这一术语。这些纳米结构诱导强效免疫反应的潜力随后得到了进一步研究。VLP平台可以克服通常与传统疫苗相关的各种问题；具体来说，与减毒活疫苗相关的传染性、向毒株的逆转、突变风险、灭活疫苗的免疫原性降低、不稳定毒性、产量低和配方时间长（图1）。
图1: VLP疫苗与传统疫苗相关风险的比较。
这些生物启发的纳米结构具有来自不同病原体的重复和高度密集的抗原，有助于触发强烈的免疫反应。此外，这些高度免疫原性分子具有病毒蛋白的自组装特性。它们是生物相容的，并在其合成过程中具有结构灵活性的潜力。它们可以通过化学或遗传方式进行修改，具有更高的稳定性、均匀性和功能性，被认为是各种生物医学应用中的有效工具（图2）。它们根据是否存在脂质膜被归类为包膜或非包膜VLP。
图2: 不同类型VLPs的生产及其应用、特性和挑战。(A) 不同的人类致病病毒和寄生虫，(B) 识别形成病原体结构特征并能导致VLPs形成的基因，(C) 将识别的基因整合到质粒等表达载体中，(D) 允许载体在各种表达系统中表达，(E) 形成不同类型的VLPs，如包膜、非包膜和嵌合VLPs。非包膜VLPs可以有两种类型：单蛋白或多蛋白。在多蛋白VLPs中，可能存在单层、多层，并且有些也是马赛克式的。嵌合VLPs可以内部、外部修改，或者可以通过化学偶联进行修改。
然而，与VLPs相关的一些关键挑战包括较低的稳定性、下游处理困难、生产成本高和对环境条件的敏感性。已经在各种表达系统（ESs）中合成了许多不同的VLP，例如细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物。基于VLP的疫苗可能用于治疗包括HIV、流感、乙型肝炎、戊型肝炎、疟疾、埃博拉病毒、SARS-CoV-2、寨卡病毒、登革热和口蹄疫在内的各种传染病。
几种基于VLP的疫苗已经获得许可，并在市场上商业化，包括Engerix-B R（GlaxoSmithKline）和Recombivax HB R（Merck & Co）针对HBV，Gardasil R（Merck & Co）和Cervarix R（GlaxoSmithKline）针对HPV，Hecolin R（厦门万泰生物技术有限公司）针对HEV，以及MosquirixTM（GlaxoSmithKline Inc.）针对疟疾。这篇综述着重于VLP疫苗开发的基础知识和技术方面的高级技术。此外，还讨论了用于VLP生产的不同ESs以及针对各种传染病，尤其是SARS-CoV-2的潜在疫苗的开发。最后，详细阐述了作为疫苗开发中承载抗原的蛋白质纳米颗粒的支架。
2. 病毒样颗粒的特性
病毒样颗粒（VLPs）通常因其独特特性（图2）而被视为有效的疫苗候选物。它们是强效的免疫刺激分子，展现出高度密集的病毒表面蛋白，以适当的构象和高度重复的方式呈现，引发强烈的T细胞和B细胞获得性免疫反应。大多数VLPs来源于病毒的衣壳或包膜蛋白，尽管核心蛋白也可以使用。VLPs天然生物相容且不具传染性，因为它们缺乏病毒遗传物质，因此无法复制。它们还被认为是比传统减毒活疫苗更安全的（不会恢复到野生型）。此外，它们是高度多功能的分子，大小从20到200纳米不等。这种大小范围是最优的，可以自由地将它们排入淋巴结，并被抗原呈递细胞（APCs），特别是树突细胞（DCs）更容易地摄取，然后通过主要组织相容性复合体（MHC）II类分子进行抗原处理和呈递。它们高度有序，可以自组装成不同的几何对称性，通常以二十面体、螺旋对称性、杆状结构或球形的形式出现，这取决于病毒的来源。
VLPs已在广泛的表达系统（ESs）中合成，包括原核（细菌）和真核（昆虫细胞、哺乳动物细胞系、植物细胞或酵母）。可以通过肽偶联、遗传融合和化学交联等不同方法，在它们的外部或内部表面展示感兴趣的异源表位，从而增加VLPs的功能。VLP技术提供了一个重要优势，因为它是一种更快的疫苗合成方法。在特定菌株测序后12-14周内就可以制备出针对该菌株的新VLP疫苗，而传统疫苗通常需要24-32周的制造过程。这些疫苗不含卵白蛋白，这对容易过敏的个体来说是巨大的缓解，并且比传统疫苗提供更强的疾病保护。
3. 基于结构的病毒样颗粒类型
根据它们的结构复杂性，VLPs可以分为两组：包膜和非包膜VLPs。两组都展示外来抗原（图2）。
3.1. 非包膜病毒样颗粒
这些VLPs通常由目标病原体或病毒蛋白结构的单个或多个自组装组分构成。这些新形成的VLPs中没有宿主细胞膜（脂质包膜）。主要病毒核衣壳蛋白的表达主要负责这些VLPs的形成。非包膜VLPs仍在作为开发针对几种病原体疾病的亚单位疫苗的首选候选物进行研究，因为它们更容易生产和纯化。此外，这些VLPs体积更小，使它们能够轻松穿过组织屏障并排入淋巴结。病毒粒子的主要结构组成部分是由单个病毒编码蛋白形成的，来源于病原体，如杯状病毒、乳头瘤病毒和小病毒，而多蛋白非包膜VLPs则更为复杂，包含多个相互作用的衣壳蛋白。它们展示了几个显著的结构特征，如多个不同衣壳蛋白的复杂同心层。它们比仅由一个主要衣壳蛋白（CP）构成的VLPs更难制造，来源于传染性腺胃炎病毒、脊髓灰质炎病毒和逆转录病毒。
3.2. 包膜病毒样颗粒
与非包膜VLPs相比，包膜VLPs（eVLPs）的组成要复杂得多。这些纳米结构由来自宿主细胞的细胞膜称为包膜，外表面有病毒蛋白存在。它们的脂质双层中嵌入了一个或多个糖蛋白刺突，作为产生中和抗体的靶抗原。这些eVLPs显示出更高的灵活性，因为它们针对相同或异源病毒的抗原表位。例如，已经开发了包含SIV的Gag蛋白和HIV的Env蛋白的eVLPs。尽管这可能会影响下游应用，因为存在宿主蛋白。eVLPs已被用于开发针对病毒疾病，如汉坦病毒、丙型肝炎病毒（HCV）、流感A和逆转录病毒的疫苗。这些大型eVLPs的尺寸大于100纳米，因此它们可能会在注射部位聚集，并且不会到达淋巴结，这限制了它们的应用。相比之下，携带mRNA疫苗的脂质纳米颗粒尺寸范围在100纳米或更小，并在将疫苗高效传递到目标部位方面显示出高效性。
3.3. 嵌合病毒样颗粒
嵌合病毒样颗粒（cVLPs）被认为是开发提供更广泛、更强大、更全面保护以应对新兴传染病的有效工具。这些复杂的多蛋白宏观结构包含不同病毒的表位。cVLPs可以通过构建编码相关病毒蛋白和外来肽或蛋白的重组DNA分子来创建。这些基因工程cVLPs在其表面展示大量重复序列，可以通过化学偶联或遗传融合从其他病毒加载外源抗原。不同的嵌合疫苗已经进行了临床试验，包括针对乙型肝炎的基于VLP的疫苗（M2–HBcAg）、抗疟疾疫苗（MalariVax）、抗流感A、抗HIV和减少吸烟者血液中尼古丁水平的尼古丁-Qb VLP疫苗。这些嵌合颗粒有利，因为它们显著增加了对外国抗原的免疫反应和抗体滴度。cVLPs给药后，它们诱导强烈的细胞溶解性T淋巴细胞免疫反应。这些疫苗还针对非传染性疾病，如高血压、阿尔茨海默症、尼古丁成瘾、过敏和糖尿病。cVLPs的上游和下游处理产量通常较低，其体内稳定性也相当不确定。
4. 病毒样颗粒作为免疫原
已经证明，与亚单位疫苗相比，VLPs具有潜在的高免疫原性和抗原性。这些颗粒的效力有可能显著诱导细胞和体液免疫（图3）。在对VLPs的反应中，各种成熟标志物如CD40、CD80和CD86在树突细胞表面表达，这些标志物负责激活树突细胞。在第一步中，树突细胞通过与树突细胞表面存在的特定模式结合，称为模式识别受体（PRRs），即Toll样受体（TLR2），来激活VLPs。随后，VLPs在树突细胞的细胞质中发生内化，并通过MHC I类和II类分子分别呈递给细胞毒性T细胞和辅助T细胞。VLPs不仅可以刺激B细胞介导抗体反应，还可以刺激CD4+和CD8+细胞增殖。一些研究表明，外源性抗原也可以通过一种称为交叉渗透的过程到达MHC I类途径。
图3: VLPs诱导先天和适应性免疫反应（A）体液免疫；（B）细胞介导的免疫），（1）基于VLP的抗原通过树突细胞等抗原呈递细胞（APCs）增强吸收和呈递，这些细胞向T细胞通报潜在风险，（2）VLP有效运输到淋巴结，这是适应性免疫反应的关键场所，（3）改善B细胞、T细胞和APCs之间的细胞通信，以及（4）基于VLP的抗原有效交联并激活B细胞受体，这些受体在抗原暴露后发展成记忆细胞和长期及短期存活的浆细胞。
此外，B细胞的激活可以通过Toll样受体（TLR）信号或同源相互作用诱导Th细胞的扩增和分化，这些相互作用控制细胞因子的产生。为了提高VLPs的效力，还可以将不同的分子如Toll样受体配体、生物活性介质或其他细胞受体附加到VLPs上。
5. 基于病毒样颗粒的商业批准疫苗
第一种重组VLP是从病毒衣壳蛋白合成的，来自乙型肝炎病毒（HBV）的两个基因（HBsAg和HBcAg）和烟草花叶病毒（TMV）。第一种通过重组DNA方法生产的商业VLP疫苗在1986年获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。这些是在酵母中生产的HBsAg疫苗，被命名为Recombivax HB R。后来，在2006年，第二种基于VLP的疫苗Gardasil R针对人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗获得了FDA的许可。此后，几种针对HPV和HBV的VLP疫苗已经获得批准，其中一些在临床和临床前试验中显示出效力。研究表明，至少有110种VLP已经从35个不同家族的病毒中生产出来。针对不同病毒的几种VLP疫苗，包括诺如病毒、HIV、埃博拉病毒、SARS-CoV-2病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒仍在不同的临床试验阶段。然而，只有少数VLP疫苗进入市场，显示出它们的商业可行性，其中大多数针对非包膜病毒有效。
6. 特定于基于病毒样颗粒疫苗平台的挑战
目前，VLPs与传统疫苗一样有效，还有更安全的额外好处。然而，在成功开发基于VLP的疫苗方面需要解决几个障碍。主要挑战是确定与下游处理有关的问题，以生产临床可行的VLPs，以便及时管理并具有经济可行性。
6.1. 包膜病毒样颗粒的稳定性
VLPs通常被认为比亚单位疫苗更稳定。然而，当环境条件发生变化时，特别是在下游处理过程中，VLPs可能变得非常不稳定，因为它们缺乏病毒的遗传物质。尽管市场上已经有多种VLP疫苗可用，但一些候选疫苗的稳定性存在问题。通常，eVLPs通常比非包膜VLPs更容易受到外部环境条件的影响。温度变化、剪切应力、溶解氧、流体动力学、搅拌速率和化学处理等条件的变化都可能影响颗粒的完整性和稳定性。此外，这种结构破坏显著降低了eVLPs的免疫原性。它还干扰细胞生长和代谢蛋白的产生，这影响了VLP的生产。这一直是将它们作为疫苗制造中活病毒替代品使用的关键障碍之一。然而，已经进行了几种修改以增加它们的热稳定性。一种典型的程序是插入稳定突变。Marsian等人进行的一项研究表明，当在3型脊髓灰质炎病毒VLP的衣壳蛋白中诱导稳定突变时，它比野生型VLP更稳定。它修改了衣壳前体和病毒蛋白酶，而不影响其抗原表位和结构确认。Schumacher等人的另一项研究通过添加C末端连接体-六组氨酸肽增加了嵌合体（HBcAg-VLP）的稳定性。
6.2. 高生产成本
一些基于VLP的疫苗在结构上更为复杂，因此生产成本更高。与eVLPs相关的众多杂质带来了巨大的挑战。在下游处理（DSP）过程中，会像包膜杆状病毒颗粒的情况一样，共同纯化各种杂质，如宿主细胞碎片（HCD）、宿主细胞蛋白（HCP）和宿主细胞DNA（HCD）。如果这些污染物在DSP期间没有正确去除，它们可能会在疫苗中引起不良副作用。大规模生产和纯化VLPs需要不同的工艺，如密度梯度或甚至色谱法，以制造最终配方产品。这些复杂工艺成本高昂且耗时。这也导致了在工业规模生产上的困难，并需要进行多项质量控制措施，因为不同的下游加工步骤可能会降低VLPs的质量。需要更健壮和更好的分析方法来确保产品的质量和数量，以便促进它们在临床和制药领域的应用。在VLPs的上游和下游加工过程中，已经实施了不同的策略，如克隆筛选、高通量筛选、生物反应器工程、材料/基质筛选、过滤、流穿或尺寸排除色谱和抛光，以实现可扩展和成本效益高的工业制造。
6.3. 组装困难
将表位序列遗传融合到VLPs中有时可能具有挑战性，因为VLPs可能会失去自我组装属性或导致颗粒错误折叠。将抗原遗传融合到病毒的衣壳蛋白通常会阻碍抗原组装或VLP，使技术变得繁琐。因此，需要耗时的规划和优化，以单独测试每个单一抗原。
7. 病毒样颗粒生产的表达宿主系统
已经使用了不同的表达系统（ESs）来制造VLP疫苗，包括植物、哺乳动物、昆虫、酵母和细菌（图4）。
图4:不同表达系统在病毒样颗粒开发中的优缺点。
11. 结论
在过去二十年中，一些病原体对商业化抗生素的耐药性急剧增加，主要是由于无监管的非处方销售、药物的滥用和过度使用以及遗传适应。药物开发是一个严格的任务，需要充足的时间、资金和重复试验，才能使一个可行的产品商业化，以帮助对抗众多新兴病原体。由于耗时的限制，特别是患者获得适当药物的机会受到阻碍，而病原体的耐药性却在持续增加。因此，预防措施对于解决传染病的紧急情况具有重要意义。在努力抗击这类疾病的过程中，VLPs在医疗行业中崭露头角，应用范围从疫苗开发、药物传递系统到分子诊断等多个领域。基于VLP的方法为疫苗开发提供了一种替代现有传统方法的选择。目前，一些针对危险病原体的基于VLP的疫苗已经商业化，如ZIKV、HCV、HBV和HPV。与此同时，正在努力生产和设计针对包括SARS-CoV-2在内的各种新兴毒株的有效VLP疫苗。然而，在基于VLP的治疗能够与传统药物疗法在成本和效果方面竞争之前，仍需要解决一些主要障碍。尽管如此，基于VLP的医疗策略未来可能会与药物制剂一起广泛使用，以帮助对抗众多传染病。
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撰写| 生物制品圈
校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea
编辑 设计| Alice
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