随着三维（3D）人类类器官在研究中的应用增加，对这些培养物的严格细胞系鉴定措施的需求也在增加。使用错误或污染的细胞系是一个已经存在了70多年的问题，这对实验结论的可信度、研究的可重复性和研究经费的有效利用产生了不利影响，甚至导致了论文的撤回。为解决这些问题，许多组织制定了指南，以确保正确的细胞鉴定。
当前的主要细胞系鉴定方法是短串联重复序列（STR）分析，这是一种重要工具，可以将细胞系追溯到单一来源。然而，STR分析只能识别已知细胞系的污染，无法检测其他物种的细胞污染。此外，STR分析难以发现长期培养过程中出现的克隆漂移问题。为弥补这些不足，PCR基于特定物种基因的检测可以用于扩增特定物种的基因。
在研究利用人类衍生的3D类器官时，确保培养物的纯净性是至关重要的。这些培养物需要高度专业化的培养基和其他培养成分来维持体外自我更新。商业来源的生长因子非常昂贵，因此许多研究人员使用由饲养细胞分泌的条件培养基（CM）。例如，Wnt家族的配体是维持肠上皮细胞干细胞生态位所必需的。然而，使用纯化重组蛋白的Wnt配体活性会降低。因此，Wnt条件培养基是提供这些重要生长因子的常见方法。这种条件培养基通常由重组小鼠细胞系生产，增加了细胞污染的风险。其他常见的培养成分也可能引入污染，如使用小鼠3T3-J2成纤维细胞饲养层和Matrigel基质。
发表在Frontiers in cell and developmental biology期刊，题为Low-Level Mouse DNA in Conditioned Medium Generates False Positive Cross-Species Contamination Results in Human Organoid Cultures的研究性文章，展示了由L-WRN细胞系产生的条件培养基中的低水平细胞游离DNA（cfDNA）可能导致PCR基于分析的类器官培养物中的跨物种污染假阳性结果。
图示描述：
1) 图1显示了通过琼脂糖凝胶电泳分析L-WRN条件培养基的PCR产物，检测小鼠特异性标记物V1rh10。结果表明，在L-WRN条件培养基和使用该培养基培养的人类类器官中检测到了小鼠DNA。代表性样本包括结肠和十二指肠组织样本，显示在病人89的组织样本中未检测到小鼠标记物，但在L-WRN细胞中作为阳性对照检测到了该标记物。
2) 样本包括未培养的初始组织、共培养的小鼠3T3-J2细胞以及使用L-WRN条件培养基培养的类器官。结果显示，共培养样本中小鼠基因的表达高于背景水平，而在类器官培养物中小鼠基因表达接近背景水平，表明这些培养物中没有活的小鼠细胞。
3) 表1总结了人类类器官培养物的DNA和mRNA分析结果。PCR检测显示所有培养物均为小鼠污染阳性，但RNA测序显示小鼠基因表达均在背景水平，进一步确认了小鼠污染来源于cfDNA而非活细胞。
4) 表2比较了L-WRN条件培养基中的cfDNA与L-WRN细胞和其母本L细胞的STR分析结果。结果显示，L-WRN条件培养基中的cfDNA与L-WRN细胞的STR分析结果高度匹配，证实了污染源来自于L-WRN细胞。
全文总结：
本研究揭示了在使用L-WRN细胞产生的条件培养基时，检测到的人类类器官培养物中的小鼠DNA污染实际上是由条件培养基中的cfDNA导致的，而非实际存在的小鼠细胞。这一发现提醒研究人员在细胞系鉴定中需要多种方法结合使用，以区分细胞污染和cfDNA污染。这一结果对许多使用小鼠来源成分的类器官培养系统具有广泛的适用性，建议在细胞系鉴定过程中采用多种检测手段确保结果的准确性。
参考文献：
Bohm MS, Dame MK, Boyd J, Su K, Wu A, Attili D, Chu V, Colacino JA, Spence JR. Low-Level Mouse DNA in Conditioned Medium Generates False Positive Cross-Species Contamination Results in Human Organoid Cultures. Front Cell Dev Biol. 2020 Nov 6;8:587107. doi: 10.3389/fcell.2020.587107. PMID: 33240885; PMCID: PMC7677229.
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