Zymeworks公司的新型喜树碱ADC荷载的分子设计与评估|单抗|喜树碱|底物|抗体|活性|细胞系

1. 新型喜树碱类似物作为 ADC 有效负载分子设计

为了设计用于ADC偶联的新型喜树碱类似物，总结利用了六十年的喜树碱构效关系 (SAR) 数据（图 1）。对活性至关重要的喜树碱结构元件包括 E 环 20(S)-羟基和内酯官能团、D 环吡啶酮以及保持 ABCDE 环的平面性。

C-7 和 C-9 位置可容纳多种取代基，包括在 exatecan 及其衍生物中看到的额外稠合环，而 C-12 至 C-14 区域内的取代会显著降低效力。C-10 和 C-11 只能容纳较小的取代基，而 11-氟喜树碱显示出更高的效力，使得只能够探索 C-7、C-9 和 C-10 位点上更多样化的取代基。

图 1.喜树碱衍生物的选定 SAR。

作者重点关注喜树碱支架的C-7（R1）和C-10（R3）位置的修饰（图3A和B），同时保持 11-氟取代基恒定且 C-9 未取代。具体来说，作者探索了具有亲水性官能团（例如胺、氨基甲酸酯、脲、磺酰胺）的类似物，这些官能团在C-7位置带有可连接的羟基，在C-10位置带有甲基或甲氧基。

此外，还评估了在 C-10 处掺入氨基的喜树碱类似物，从而提供替代接头的位置。设计了大约 100 种喜树碱小分子的文库。

对这些新型喜树碱和选定的临床小分子进行 SAR 分析（图 3C），比较它们的体外效力和疏水特性，突出了几个趋势。值得注意的是，大多数在 C-10 位具有甲基的化合物（图 3C，橙色）显示 pIC50≥ 8.0（即 IC50< 10 nmol/L），疏水特性的巨大变化（clogD 范围为 -1 至 3）。在 C-10 处具有胺的类似物（图 3C，绿色）比 C-10 甲基类似物相对更有效且更亲水（即具有改进的配体亲脂效率）。相反，带有 C-10 甲氧基取代基的喜树碱（图 3C，蓝色）的效力较低，亲水性没有显著改善；因此，没有进一步研究任何C-10甲氧基化合物。

从该文库中，选择了 7 种在 C-10 处具有甲基或氨基且在 C-7 处具有广泛的效力、亲水性和结构多样性的化合物（FD1–FD7，图 3B），用于研究药物接头（图3D）。采用了经过临床验证的可裂解四肽序列 GGFG 与含聚乙二醇 (PEG) 的马来酰亚胺，特别是马来酰亚胺基三甘醇 (MT) 丙酰基部分的组合。含 PEG 的马来酰亚胺已与不同有效负载类别的各种 ADC 一起使用，并且已知有助于补偿疏水性和聚集等次优有效负载特性。

在 C-7 位上带有氨基甲酸酯 (FD1)、酰胺 (FD2) 或磺酰胺 (FD3) 的三个 C-10 甲基类似物通过伯醇使用自裂解氨基亚甲基间隔基连接以获得DL1-4。对于FD4、FD5、FD6 和 FD7，四肽裂解序列通过可酶裂解的酰胺键直接连接到 C-10 胺基，以获得DL9-14。

2. 曲妥珠单抗ADC是分散的、亲水的，并表现出抗原依赖性的细胞毒性

八个含 MT 的药物接头（DL1、DL3、DL4、DL5、DL9、DL11、DL13 和 DL14）代表七种独特的有效负载，连同 DL7（DXd）和 DL6（含 MC 的 FD5）缀合到完全还原的曲妥珠单抗（抗 HER2）的铰链二硫键，以实现大约 8 的 DAR。根据相对于未缀合的曲妥珠单抗的 HIC 保留时间评估，所得 ADC 显示出最小（<5%）的聚集和良好的亲水性（HIC-RRT，表 1）。

接下来，在 HER2 阳性细胞系 (SK-BR-3) 和 HER2 阴性细胞系 (MDA-MB-468；表 1；图 4A) 中评估这些 ADC 的效力和抗原特异性。携带 C-10-甲基有效负载的三种 ADC（T-DL1、T-DL3、T-DL4）在 SK-BR-3 细胞中表现出亚纳摩尔细胞毒性；然而，T-DL4 在 HER2 阴性 MDA-MB-468 细胞中显示出个位数 nmol/L 的效力，表明该 ADC 存在潜在的接头不稳定性。

负载带有 C-10 胺的四种 ADC（T-DL9、T-DL11、T-DL13、T-DL14）显示出明显不同的结果：携带 FD5 和 FD6 的 ADC 在 SK-BR-3 中异常有效，而带有FD4 和 FD7 在同一细胞系中的效力要低 100 至 1,000 倍。值得注意的是，无论接头连接（C-7 或 C-10）和锚定（MC 与 MT）如何，T-DL5、T-DL6 和 T-DL11 都显示出相同的活性，这突显了接头位置和锚定类型如何影响这三种携带相同 FD5 有效负载的不同 ADC 的体外细胞毒性。

表格1.ADC 和相应有效负载在高抗原 (SK-BR-3) 和抗原阴性 (MDA-MB-468) 细胞系以及 ADC HIC RRT 中的体外活性。

图 4.A

3. 曲妥珠单抗 ADC 在体外表现出一系列旁观者活性

旁观者活动被认为是 T-DXd 的一个关键特征，这可能有助于在临床上观察到不同 HER2 表达肿瘤患者的活性，包括 HER2 低、HER2 阴性或 HER2 异质肿瘤患者。在体外旁观者效应测定中将携带新型喜树碱有效负载的 ADC 与 T-DXd 进行了比较。简而言之，HER2阴性MDA-MB-468细胞在单一培养物或与HER2高SK-BR-3细胞共培养物中生长，然后用0.1或1 nmol/L ADC处理（图4B和C）。

已知旁观者无活性喜树碱 ADC（T-ME-PEG2-GGFG-DXd2）作为阴性对照。在 1 nmol/L 浓度下，携带有效负载FD1、FD5 和 FD6 的 ADC 显示出与 T-DXd 相似的旁观者活性。然而，过度的旁观者活动也可能是一把双刃剑，可能导致有毒有效载荷迅速扩散到健康组织中。因此，在追求最有效的旁观者有效载荷时，必须评估毒理学研究中高旁观者活动的影响，而不是依赖绝对值。

4. ADC 和游离药物在小鼠血浆和 pH 7.4 缓冲液中孵育后表现出不同的稳定性

在小鼠血浆中7 天以评估九种 ADC 的稳定性，然后进行免疫沉淀-质谱分析。对于携带通过 C-10 胺或 C-7 醇连接的有效负载 FD1、FD2、FD4、FD5 和 FD7 的 ADC，没有观察到分解。

喜树碱小分子和基于喜树碱的 ADC 也容易发生光降解，因此需要小心处理以尽量减少光照射。为了评估光稳定性，将游离药物在透明或琥珀色小瓶中在 pH 7.4 PBS 中室温孵育。在透明小瓶中，随着时间的推移，观察到所有类似物部分或完全降解，其中 FD1、FD3、FD5 和 FD6 在 16 天内分别显示母体化合物损失 10%、50%、22% 和 100%。相比之下，琥珀色小瓶中的所有游离药物均稳定，但 FD6 除外，FD6 在第 16 天时显示出完全氧化。此外，FD1中的氨基甲酸酯官能团在酸性和碱性条件下都很稳定，在0.1 mol/L HCl (pH ∼1.0)或0.1 mol/L Na2CO3。

5. 旁观者效应ADC 在 JIMT-1 CDX 模型中表现出强大的活性

为了评估不同的有效负载效力、旁观者活性和连接体稳定性如何影响体内功效，用单次 3 mg/kg ADC 剂量治疗植入表达 HER2-mid JIMT-1 肿瘤的小鼠（图 4D）。选择 T-DM1 耐药的 JIMT-1 乳腺癌细胞系作为严格的体内 CDX 模型来区分测试物品。用 T-DL9 和 T-DL14 治疗的小鼠观察到肿瘤持续消退，其体外二维 (2D) 细胞毒性较差，但旁观者活性较高。携带有效负载FD1、FD3、FD5 和 FD6的 ADC 显示出最初的肿瘤消退，然后再生长，与包含 DXd 的 ADC T-DL7 相当（图 4E）。由于稳定性差和/或缺乏活性，含有 FD2、FD3 和 FD6 的 ADC 被排除在进一步评估之外。

6. 使用 3D 球体检测体外细胞毒性重现了观察到的体内活性

对于有效负载选择，使用一组在 2D 培养中表达 HER2 的细胞系筛选游离药物。然而，对于 ADC，当以 2D 格式培养时，大多数细胞系观察到最小活性和/或非 S 形曲线（SK-BR-3 除外）。

先前有报道称，3D 球体细胞测定可以更准确地表示体内肿瘤环境。在球体测定中评估的 ADC 的细胞毒性（图 4F）与体内肿瘤生长抑制结果（图 4D）之间存在很强的相关性（图 4G），突出了球体细胞毒性测定的实用性对于此类有效负载。此外，这种测定形式能够测量其他细胞系的 IC50值，这些细胞系不适用于喜树碱 ADC 的传统 2D 细胞毒性测定。

7. 携带 FD1 和 FD5 的抗 FRα ADC 在小鼠中具有良好的耐受性

曲妥珠单抗-ADC 的 JIMT-1 CDX 研究令人鼓舞的结果促使在针对 HER2 以外的肿瘤相关抗原 (TAA) 的不同抗体的背景下研究主要药物接头。

携带有效负载 FD1、FD4、FD5、FD7 和 DXd 的药物接头与抗叶酸受体 α (FRα) 抗体的缀合产生了 ADC 抗 FRα-DL1、抗 FRα-DL9、抗 FRα-DL5、抗然后评估 FRα-DL11、抗 FRα-DL14 和抗 FRα-DL7 的体内耐受性。在非荷瘤 BALB/c 小鼠中，携带 FD1 或 FD5 的三种 ADC 在 60 和 200 mg/kg 剂量下均具有良好耐受性，且体重损失极小（图 5A 和 B），类似于与 DXd 缀合的 ADC。然而，在用 60 和 200 mg/kg 剂量携带FD4 或 FD7的 ADC 治疗的所有小鼠中观察到死亡率，这表明 ADC 的强活性具有相当毒性。

图 5.A 和 B

8. 有效负载 FD1 和 FD5 表现出独特的理化和体外 ADME/DMPK 特性

在 Caco-2 测定中，FD1、DXd 和 SN-38被确定为 MDR1 的底物。FD1 和 DXd 被认为是 BCRP 的可能/边缘底物，因为在存在或不存在 BCRP 抑制剂的情况下流出率较低。相反，FD5 和 exatecan都不是任一外排泵的底物。

在人肝微粒体测定中，FD1、DXd 和 exatecan经历一级代谢，其中 C-10 氧化是主要代谢产物。DXd 显示额外的 F 环处发生进一步氧化。观察到 exatecan 的降解明显更多，可能是因为它的苄胺。FD5观察到最小程度的氧化，重要的是，C-7 醇不是 UDP-葡萄糖醛酸基转移酶的底物，而 UDP-葡萄糖醛酸基转移酶是与 SN-38 前药（例如伊立替康和 SG）相关的胃肠道毒性的已知来源。所有化合物在人类和 NHP 中均与血浆蛋白高度结合；然而，FD5 在啮齿类动物中的结合相对较少。

9. 抗 FRα-DL2 (MC-GGFG-AM-FD1) ADC 在 Sprague Dawley 大鼠中表现出优异的耐受性

为了进一步地，目前MT 被临床验证的 MC 连接所取代。MC 连接子已在 FDA 批准用于多种适应症的五种ADC（Trastuzumab deruxtecan、brentuximab vedotin、polatuzumab vedotin、enfortumab vedotin、tisotumab vedotin）中得到验证。MC 避免了高度稳定的接头-抗体偶联，这可能导致出现意外的毒性。

含有 MC 的 DL2、DL6、DL8、DL10 和 DL12 用于生成相应的 FRα ADC（抗 FRα-DL2、抗 FRα-DL6 和抗 FRα-DL12，以及带有 DXd 的抗 FRα- DL8 和耐受性较差的抗 FRαa-DL10），在使用 Sprague Dawley 大鼠的两剂量耐受性研究中对其进行了评估（图 5C-E）。

正如小鼠耐受性研究中所见，FD4 ADC（抗FRα-DL10）治疗导致所有大鼠在单次 60 或 200 mg/kg 剂量后死亡，并在 30 mg/kg 剂量后出现短暂体重减轻。抗FRα-DL2在 30、60 和 200 mg/kg 剂量下表现出最大的耐受性，没有重大的宏观或微观发现。对于携带FD5（抗FRα-DL6 和抗 FRα-DL12）的两种 ADC，在 200 mg/kg 剂量下观察到 6 只动物中的 1 只出现死亡，并且所有动物在 200 mg/kg 剂量后出现短暂体重减轻抗 FRα-DL6。耐受性的差异可归因于有效负载的不同特性，而不是 ADC 药代动力学的差异。根据 ADC 耐受性结果和总体小分子体外 DMPK 概况，选择FD1 (ZD06519)作为开发多个 ADC 候选药物的主要有效负载。