TIM3 : 靶向治疗肿瘤与免疫的新靶点|t细胞|介导|免疫|受体|抗原|肿瘤|靶向治疗

本文介绍了检查点受体TIM3 的机制，并且抑制 TIM3 可以增强 PD1 阻断的抗肿瘤效果。

1. 背景介绍

T 细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域蛋白 3 (TIM3，T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3 ) 于 2002 年首次发现，是免疫调节蛋白 TIM 家族的成员。它们的结构域包括: 由氨基末端免疫球蛋白可变结构域（V结构域）和五个非典型半胱氨酸、粘蛋白茎、跨膜结构域和细胞质尾组成。TIM 家族成员由人类中的 3 个基因（HAVCR1、HAVCR2 和 TIMD4，分别编码 TIM1、TIM3 和 TIM4）；而小鼠中由 8 个基因编码。TIM家族的基因位于与过敏和哮喘相关的基因组区域，靠近IL4、IL5和IL13基因座的着丝粒末端。

在 TIM 家族中，TIM3 与自身免疫和癌症中免疫反应调节的相关性而受到最多关注。尽管它最初被鉴定为由产生干扰素-γ (IFNγ) 的 CD4+和 CD8+T 细胞表达的分子，但许多其他细胞类型，包括调节性 T 细胞（Treg细胞）、骨髓细胞、自然杀伤 (NK) 细胞和肥大细胞，已被证明可以表达 TIM3。因此，TIM3 的治疗靶向可能通过作用于多种细胞类型来调节免疫反应。目前正在临床试验中研究通过阻断 TIM3 来治疗癌症，同时抑制检查点受体，例如LAG3和TIGIT。

2. TIM3的结构和信号通路

TIM3 的一个独特特征是其细胞质尾部缺乏已知的抑制信号基序（图 1）。PD1和 TIGIT 等更“经典”的检查点受体不同，它的细胞质尾部含有 5 个在人类和小鼠之间保守的酪氨酸。尽管精确的细胞内信号传导机制尚未完全阐明，但已知 Tyr256 和 Tyr263 可以与BAT3和酪氨酸激酶 FYN互作。TIM3 存在于脂筏中，并在 T 细胞激活时被招募到免疫突触，在那里它可以与 BAT3 和酪氨酸激酶 LCK相互作用。当 TIM3 未与配体结合时，BAT3 与其细胞质尾部结合并招募 LCK 的活性催化形式。在这种状态下，TIM3 允许 T 细胞激活。可溶性凝集素Galetin 9 和粘附分子癌胚抗原相关细胞粘附分子 1 (CEACAM1) 是 TIM3 的两种配体，均显示可通过酪氨酸激酶 ITK磷酸化TIM3。FYN 可能有助于 TIM3 介导的抑制信号传导，因为已知 FYN 与 BAT3 结合 TIM3 的相同区域，这表明 FYN 和 BAT3 之间对 TIM3 结合存在潜在竞争。此外，已知 FYN 通过激活与PAG 相关的磷蛋白来诱导 T 细胞无反应性，导致酪氨酸激酶 CSK 的募集，然后在抑制性残基上磷酸化 LCK，导致 T 细胞受体 (TCR) 信号传导受到抑制。TIM3 还可以与受体磷酸酶 CD45 和 CD148 结合并破坏免疫突触，这已被认为是 T 细胞抑制的另一种机制。

TIM3结构域

图 1：TIM3-配体相互作用模型。

另一方面，在短期 TCR 刺激的情况下，Jurkat 细胞中 TIM3 的异位表达被证明可以促进 TCR 信号传导。此外，TIM3 表达与 AKT 雷帕霉素机制靶点 (mTOR) 信号传导增加相关，这被认为是 TIM3 共刺激的标志。

TIM3 也以可溶形式存在，缺乏粘蛋白和跨膜结构域。在小鼠中，这种形式可能是通过交替剪接产生的；然而，这种剪接变体在人类中是否存在存在争议。相反，有人提出可溶性 TIM3 是金属蛋白酶依赖性裂解的结果，有利于其从细胞表面脱落。也假设它可能充当诱饵受体并充当 TIM3 配体的“分子汇”，从而干扰 TIM3 的抑制功能。相比之下，体外实验表明可溶性TIM3可以减少T细胞产生IL-2。

3. TIM3的主要配体

据报道，TIM3 具有多种不同的配体:半乳糖凝集素 9、磷脂酰丝氨酸 (PtdSer)、CEACAM1 和HMGB1，它们与 TIM3 胞外免疫球蛋白 V 结构域上的不同区域结合。

3.1半乳糖凝集素9

半乳糖凝集素 9，这是一种由许多造血细胞广泛表达和分泌的 C 型凝集素，可与细胞表面蛋白上的糖基化部分结合。在 TIM3 上，它与免疫球蛋白 V 结构域上的糖基化基序结合，可诱导 TIM3+T 细胞中的细胞内钙内流和细胞死亡（图 1）。半乳糖凝集素 9 结合导致 TIM3 在细胞表面寡聚化，诱导 BAT3 从 TIM3 的细胞内尾部释放。这反过来会导致 T 细胞抑制并最终导致细胞死亡。

重要的是，还有证据表明半乳糖凝集素 9 可以发挥独立于 TIM3 的作用。例如，体外实验表明，半乳糖凝集素 9 可以增强 T 辅助 1 细胞（TH1 细胞）和 TH2 细胞中细胞因子的产生并抑制TH17细胞分化。这与 TIM3 表达无关，但需要未知糖蛋白和 IL-2 的 O 连接糖基化。TIM3 上半乳糖凝集素 9 的精确结合位点尚未明确定义，因为它需要预测小鼠和人类 TIM3 之间不同的糖基化位点；然而，预测在小鼠 TIM3 中可以进行糖基化的残基包括 Thr44、Asn100 和 Asn74。由于半乳糖凝集素 9 不结合在由 TIM3 的 FG 和 CC' 环构成的独特口袋中，因此预测 TIM3 必须具有与该口袋结合的额外配体。

3.2磷脂酰丝氨酸

TIM1、TIM3 和 TIM4 晶体结构解析导致了 PtdSer 的发现，PtdSer 是一种磷脂，可作为凋亡细胞的表面标记，作为所有 TIM 的配体家庭成员。

PtdSer化合物结构

PtdSer 与 TIM3 免疫球蛋白 V 结构域中的 FG 和 CC' 环构成的口袋结合，与涉及氨基酸 Asn119 和 Asp120 的协调钙结合。然而，与其他TIM家族成员相比，TIM3结合PtdSer的亲和力至少低五倍。值得注意的是，PtdSer 的结合位点相对于半乳糖凝集素 9 结合的预测位点位于免疫球蛋白 V 结构域的另一侧，并且似乎受到等位基因多态性的影响。尽管 PtdSer 与 TIM3 的结合不会导致 T 细胞吞噬和吞噬凋亡物质，但推测它对TIM3+树突状细胞 (DC)的抗原交叉呈递很重要。

3.3 HMGB1

报警素(alarmin)HMGB1是TIM3+DCs的配体，但其结合位点尚未确定。HMGB1 与死细胞释放的 DNA 结合，促进 Toll 样受体 (TLR) 的核酸感应。HMGB1也可由肿瘤细胞分泌。因此，肿瘤微环境中的TIM3+骨髓细胞可能充当HGMB1的分子库，从而干扰其在先天免疫激活中的功能（图2）。

3.4 CEACAM1

最近发现的 TIM3 配体是糖蛋白 CEACAM1，已知它在调节抗病毒反应中发挥作用。在体外，重复暴露于这些抗原后，CEACAM1 与 TIM3 在卵清蛋白肽刺激和金黄色葡萄球菌内毒素 B 刺激的 T 细胞上共表达，因此被认为有助于建立 T 细胞耐受。

CEACAM1 被认为与 TIM3 的 CC' 和 FG 环结合。还发现 CEACAM1 能够在细胞内结合 TIM3，这似乎对于 TIM3 的成熟很重要，因为在 HEK293 细胞中共表达的 TIM3 或 CEACAM1 的突变体形式会导致细胞内 TIM3 积累和 TIM3 低糖基化。T 细胞表达的 TIM3 表面水平降低，同时产生更多的效应细胞因子 IFNγ、肿瘤坏死因子 (TNF) 和 IL-17A。除了由 T 细胞表达外，CEACAM1 还由 DC、单核细胞和巨噬细胞表达。因此，TIM3-CEACAM1 轴可能会抑制 T 细胞和骨髓细胞中顺式或反式的免疫反应。顺式相互作用促进成熟TIM3在细胞表面的稳定性，顺式和反式相互作用均介导TIM3的抑制功能。

3.5 多种配体相互作用

值得注意的是，所有具有抗肿瘤活性的抗 TIM3 抗体都能够干扰 PtdSer 和 CEACAM1 结合，但不能干扰半乳糖凝集素 9 与 TIM3 的结合。这就留下了半乳糖凝集素 9 是否以及如何在肿瘤 TIM3 信号传导中发挥作用的问题。研究表明，具有两个糖基化位点识别结构域的半乳糖凝集素 9 可以在与其他配体（如 CEACAM1 和 PtdSer）复合的 TIM3 与免疫突触处的磷酸酶 CD45 和 CD148 之间形成分子桥。

鉴于 TIM3 配体的多样性，很难推测 TIM3+细胞如何区分这些配体。由于目前 TIM3 与其所有配体的亲和力尚不清楚，因此给定组织微环境中每个配体的分布和个体表达水平可能决定通过 TIM3 的信号传导。事实上，一些组织，例如胃肠道，特别是结肠，含有表达高水平 CEACAM1 的细胞，而其他组织，例如肝脏的组织，则高表达半乳糖凝集素 9。

4. TIM3在免疫调节中的作用

4.1 TIM3 在移植耐受和自身免疫中的作用

TIM3 最初被鉴定为 IFNγ 分泌效应 CD4+TH1 细胞和 CD8+1 型细胞毒性 T 细胞，后来发现由人类 TH1 细胞表达。发现 TH1 细胞转录因子 T-bet 与其他转录调节因子（包括 NFIL3）合作调节 TIM3 表达， PRDM1 和 MAF。用 TIM3 阻断抗体或可溶性 TIM3-免疫球蛋白融合蛋白（作为 TIM3 配体的分子库）治疗小鼠，会加剧自免模型中的疾病，并导致 TH1 细胞免疫和巨噬细胞增强过度激活。这首次表明 TIM3 可能作为抑制分子发挥作用，限制 IFNγ 驱动的炎症。

4.2 TIM3 在结核杆菌感染中的作用

结核分枝杆菌感染仍然对人类健康构成严重威胁。在小鼠慢性结核分枝杆菌感染期间，CD8+T细胞上的TIM3表达升高。同样，结核病患者的总CD8+T细胞和抗原特异性CD8+T细胞上TIM3表达升高。体内注射TIM3-免疫球蛋白融合蛋白可减少结核分枝杆菌感染小鼠的结核分枝杆菌负担。进一步的体外分析表明，TIM3+T 细胞与巨噬细胞上的半乳糖凝集素 9 相互作用，触发巨噬细胞产生 IL-1β，从而限制巨噬细胞内结核分枝杆菌的复制。

4.3 TIM3 在肿瘤和慢性病毒感染中的作用

成功抗肿瘤免疫的一个关键障碍是 T 细胞功能障碍或 T 细胞耗竭，这是一种以促炎细胞因子产生和细胞毒性受损为特征的细胞状态，是因持续暴露于抗原而产生的，尤其是在慢性病毒感染和癌症。

TIM3 是 HIV 感染患者 CD8+T 细胞高度功能障碍亚群的标志物，体外实验表明，用抗体阻断 TIM3 可以恢复 TIM3+CD8+T 细胞转化为 HIV-1 肽。随后，发现 TIM3 表达是慢性病毒感染（丙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒 (HBV) 感染）以及小鼠感染模型（淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒感染、HBV 感染、弗兰德病毒感染）的标志物，表现为T细胞功能失调。此外，TIM3水平与许多病毒感染中的病毒载量和疾病进展呈正相关，这与其提出的抑制作用一致。

TIM3 是癌症中肿瘤浸润 CD8+PD1+T 细胞中功能最失调细胞的标志物。因此，TIM3 和 PD1 的抗体阻断在抑制肿瘤生长和改善患者来源的肿瘤抗原特异性 CD8+T 细胞反应方面具有协同作用。相比之下，T 细胞上的 TIM3 过度表达会加剧 EL4 小鼠淋巴瘤模型中的肿瘤进展。除了 TIM3+CD8+T 细胞外，TIM3+Treg细胞也可能是TIM3 抗体治疗的目标。TIM3+Treg细胞是肿瘤中主要的 Treg细胞群，它们的存在与肿瘤的严重程度和进展相关。例如，在肺癌患者中，60% 的 Treg细胞被发现表达 TIM3，在肝细胞癌患者中，70% 的 Treg细胞被发现表达 TIM3。在结直肠癌小鼠模型中，TIM3+Treg细胞占总 Treg细胞的 50% 以上，这一比例远远超过其相对肿瘤引流淋巴结、脾脏或血液中的比率。此外，在MC38结肠癌小鼠模型等肿瘤模型中，绝大多数CD4+TIM3+T细胞也表达FOXP3（~90%），表明它们是Treg细胞。事实上，TIM3 阻断与 PDL1 阻断相结合会导致体内 TIM3+Treg细胞中 Treg细胞效应分子的下调，降低Treg细胞数量和抑制肿瘤生长。

TIM3 还可作为结肠癌、胃癌和宫颈癌、非小细胞肺癌和透明细胞肾癌等实体瘤的预后标志物，高水平的 TIM3 表达与较低的生存率相关，反之亦然。在 HBV 相关肝细胞癌患者中也获得了类似的结果，这些患者的生存率与 TIM3+T 细胞的存在呈负相关。在 HBV 阴性的肝细胞癌患者中，CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞上的 TIM3 表达极少。

TIM3 表达也在恶性造血细胞中观察到，特别是 AML 细胞。TIM3 在这些肿瘤中的白血病干细胞中高度表达，但在正常造血干细胞中不表达。TIM3 对白血病干细胞的确切作用尚不清楚；然而，抗 TIM3 抗体阻断可以改善 AML 异种移植模型中的疾病，表明 TIM3 既可以作为生物标志物，也可以作为临床靶点。

TIM3 与 PD1 的共表达使其成为检查点靶向癌症免疫疗法的一个有吸引力的靶标。在临床前模型中，与TIM3-相比，在 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞以及 TIM3+PD1+中表达的效应细胞因子 IFNγ、TNF 和 IL-2 的量明显较低。此外，PD1 靶向治疗可导致 TIM3 上调；这已被证明是PI3K–AKT 介导的。在黑色素瘤、结直肠癌和 AML 小鼠模型中，与单独阻断 PD1 通路相比，联合阻断 TIM3 和 PD1 通路可更好地恢复 T 细胞反应。在丙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒感染的小鼠模型中也有类似的结果。

与 TIM3 是癌症和慢性病毒感染中最功能失调的 T 细胞亚群的标记物这一观察结果一致，最近注意到 TIM3 表达是失去 Tcf7（编码 TCF1）表达的 T 细胞的标记物，一种维持干性并抑制效应分化的转录因子。因此，TIM3和TCF1表达之间存在负相关，其中TCF1表达可以作为干细胞样细胞的标记，而TIM3表达可以作为终末分化效应细胞和无法通过检查点封锁重新激活的衰竭细胞的标记。事实上，表达 TCF1 的 PD1−T 细胞和 PD1+T 细胞的存在对于检查点阻断的反应至关重要。

5. TIM3 在非 T 细胞中的作用

尽管最初认为 TIM3 仅由 T 细胞表达，但现在人们认识到 TIM3 由多种细胞类型表达，包括 DC、巨噬细胞、骨髓源性抑制细胞和 NK 细胞。目前对这些非 T 细胞群中 TIM3 生物学的了解是有限的。

骨髓细胞中 TIM3 表达与 TLR 激活调节之间似乎存在密切联系。体外实验表明，在通过多种不同TLR刺激的单核细胞和巨噬细胞中，TIM3抗体阻断或用siRNA敲低TIM3会增加许多细胞因子的产生以及TLR2和TLR4的表达，表明TIM3是TLR反应的负调节因子。

巨噬细胞上的 TIM3 过度表达似乎可以减弱对葡聚糖硫酸钠的大量炎症反应，从而预防不良的组织疾病。与此一致的是，在急性脓毒症患者的外周血单个核细胞中，TIM3 的表达上调，但在严重脓毒症患者中，TIM3 的表达受到抑制。TIM3 在怀孕期间的人外周血单核细胞上也高度表达，其中 TIM3 似乎会减弱对 TLR4 刺激的反应。

据报道，TIM3 在巨噬细胞中具有不依赖于 TLR 的作用。TIM3 可以作为转录因子 STAT1的衔接蛋白，与 TIM3 胞内尾部的 Tyr256 和 Tyr263 结合。这会抑制炎症性 microRNA miR-155 的转录，并增强 SOCS1 的功能，SOCS1 是 Janus 激酶 (JAK) 信号传导的负调节因子。这反过来又促进 M2 巨噬细胞极化。

鉴于 TIM3 通过与 PtdSer 结合介导细胞凋亡物质的捕获，其在小鼠巨噬细胞和 CD8+DC 上的表达可以促进交叉呈递。值得注意的是，TIM 家族的其他成员，例如 TIM1 和 TIM4（后者在几种组织驻留巨噬细胞和 DC 上高度表达），对 PtdSer 具有更高的亲和力，因此在摄取凋亡物质方面更有效。TIM3 对 PtdSer 的较低结合亲和力是因为 TIM3 在 FG 和 CC' 环中仅具有介导与 PtdSer 相互作用的四个保守残基中的两个。

TIM3 也由成熟静息 CD56dimNK 细胞表达，并在响应细胞因子刺激激活时进一步上调。TIM3 的高表达是效应 NK 细胞的标志，这些细胞正在产生 IFNγ 并正在进行脱颗粒。然而，与癌症中 T 细胞的表达类似，TIM3 可能是功能失调的 NK 细胞的标志物。因此，TIM3 阻断已被证明可以逆转从黑色素瘤患者血液中纯化的 NK 细胞的 NK 细胞功能障碍。

在肥大细胞上，TIM3 被认为具有激活功能，这与它在其他免疫细胞中的作用相反。TIM3 抗体在 IgE 致敏和体外抗原依赖性激活后增强肥大细胞中 IL-3、IL-4、IL-6 和 IL-13 的分泌。此外，体外实验表明，TIM3 的基因删除或 siRNA 敲低均显着减少了肥大细胞激活后 IL-6 的产生，并且 TIM3 的基因删除消除了抗原介导的糖酵解，这是由 FcεRII 受体介导的作用。需要进一步研究来破译 TIM3 信号在肥大细胞中的作用及其对过敏和肥大细胞生物学的重要性。

6. 药物开发

在TIM-3赛道中，数据库中查到55款药物开发。目前，已有两款进入3期临床。GSK的Cobolimab（TSR-022）是由收购Tesaro获得。与Sabatolimab不同，Cobolimab开发的适应症聚焦于非小细胞肺癌、肝细胞癌、黑色素瘤等实体瘤。其他罗氏的PD-1xTIM-3双抗已进入临床2期。其他TIM-3药物都处于更为早期的阶段。值得一提的是，礼来已终止两项TIM-3项目，分别是TIM-3单抗LY3321367和PD-L1xTIM-3双抗LY3415244。总的来说，由于其人鼠中的巨大差异和机制复杂等问题，临床开发需进一步验证。