正畸牙齿移动（OTM）是由机械力诱导的牙槽骨重塑过程，并受局部无菌炎症的调节，其潜在机制对解剖至关重要。巨噬细胞作为机械敏感细胞，通过分泌细胞因子和调节局部炎症在OTM中起着至关重要的作用。研究证明，骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）具有显著的自我更新能力和多向分化潜能，是成骨细胞的前体细胞，可以直接响应机械力并促进OTM期间牙槽骨的形成。因此，在机械力下巨噬细胞与BMSCs的相互串扰以促进其成骨的过程可能是OTM期间机械力诱导牙槽骨形成的重要组成部分。
越来越多的证据表明，外泌体在骨重塑微环境中介导了巨噬细胞和BMSCs之间的通讯。外泌体的双层膜结构能很好的保护其包被的物质，如核酸、蛋白质和脂质等。此外，外泌体可以直接被BMSCs内吞，而不是被某些反馈机制（如细胞因子）抑制。然而，在机械力作用下，来自巨噬细胞的外泌体是否以及如何调节BMSCs成骨以及牙槽骨形成仍然未知。
基于此，南京医科大学附属口腔医院口腔正畸科及江苏省心血管病转化医学协同创新中心的研究团队进行了深入探索，表明了机械力调节骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）分泌的外泌体泛素羧基末端水解酶同工酶L3（UCHL3），它通过靶向Smad同源物1（SMAD1）促进BMSCs成骨，从而促进OTM期间牙槽骨形成。研究成果发布于JournalofNanobiotechnology期刊题为“Mechanicalforceinducesmacrophage-derivedexosomalUCHL3promotingbonemarrowmesenchymalstemcellosteogenesisbytargetingSMAD1”。
首先，为了模拟体外OTM期间的BMSCs成骨，构建机械力反应培养系统，其中BMDMs用暴露于不同的机械刺激（MS），然后收集其上清液来处理BMSCs（图1a）。通过CCK-8分析测定BMDMs在不同应变水平（0.5Hz，0、5、10、15%）或持续时间（0、2、6、10h）影响下的活力，发现无论时间如何变化，10%应变水平下其细胞活力显著增加，因此将其作为进一步实验的标准应变幅度。
qRT-PCR、WB及ALP染色显示，与其他组相比，MS（10%，6h）-BMDMs衍生的条件培养基显著增加了BMSCs中成骨基因（Alp、Runx2Col1和Ocn）（图1b-e）、成骨转录因子RUNX2（图1f、g）、ALP水平的表达（图1h），且细胞外基质矿化沉积增强（图1i）。这些结果证实了适度的机械力促进了BMDM-介导的BMSC成骨。
随后，探索可能在MS-BMDMs上清液中介导BMSCs成骨的参与者，并将重点放在外泌体上。TEM显示，这些纯化的囊泡具有杯状或球形形态（图1J），直径主要在30-200nm之间（图1k）。WB进一步证实，这些颗粒上存在CD63和TSG101等外泌体表面标志物（图1l）。此外，MS-BMDMs的上清液具有比BMDMs更多的外泌体（图1m）。这些数据表明，这些纳米颗粒是外泌体，机械力促进了BMDMs衍生的外泌体的分泌。基于这些发现，可以推测外泌体可能是MS-BMDMs分泌的影响BMSCs成骨的关键介质。
为了证实源自MS-BMDMs的外泌体在介导BMSCs成骨中的潜在作用，用荧光染料Dil标记MS-BENDM-EXOs，并用这些外泌体处理BMSCs12h，发现MS-BMDM-EXOs显著促进了成骨基因的mRNA表达和RUNX2蛋白水平、ALP水平和细胞外基质矿化沉积。这表明，来自MS-BMDMs的外泌体促进BMSCs中的成骨。
接下来，为了探索MS-BMDMs衍生的外泌体在OTM期间牙槽骨形成中的作用，建立了小鼠OTM模型，并注射GW4869（外泌体分泌抑制剂）。压缩力（10g）作用14天后，GW4869显著抑制了牙齿移动，牙槽骨骨体积分数（BV/TV）显著降低，张力侧的ALP阳性表面受到抑制，从而表明抑制外泌体会损害OTM期间牙槽骨的形成。局部注射PBS、BMDM-EXOs和MS-BMDM-EXOs到负荷牙齿中，14天后，发现BMDM-EXOs处理大大提高了负荷牙齿牙槽骨的BV/TV，并且MS-BMDM-EXOs进一步增强了这种效果。ALP染色结果呈现相同的效应。这些结果表明，来自MS-BMDMs的外泌体促进了牙齿移动过程中牙槽骨的形成。
进一步地，通过蛋白质组学分析MS-BMDM-EXOs和BMDM-EXOs中的蛋白表达谱。在MS-BMDM-EXOs组的上调蛋白中，发现了UCHL3的富集，其参与细胞蛋白质修饰过程。WB结果进一步揭示，BMDMs中的UCHL3蛋白水平高于BMSCs，机械力增加了BMDMs和BMDM-EXOs中UCHL3的蛋白水平。因此，UCHL3可能是MS-BMDM-EXOs中最重要的因子之一。
使用TCID（UCHL3抑制剂）处理BMSCs，发现其显著降低了成骨基因、RUNX2蛋白（图2a-c）及ALP表达水平和细胞外基质的矿化沉积（图2d、e）。这表明，UCHL3对BMSCs的成骨至关重要。然后，使用siUchl3敲低MS-BMDMs中Uchl3的表达（图2f、g），MS-BMDMsiUchl3-EXOs中UCHL3蛋白水平得到有效抑制（图2h），然后用MS-BMDMsiCon-EXOs和MS-BMDMsiUchl3-EXOs处理BMSCs。结果显示，与对照组相比，MS-BMDM-EXOs中UCHL3下调后，BMSCs中成骨基因、RUNX2蛋白水平显著下调（2i-k），ALP水平和细胞外基质矿化沉积也受损（图2l、m）。这些结果表明，UCHL3是MS-BMDM-EXO介导的BMSC成骨所必需的。
为了确定UCHL3在OTM期间介导牙槽骨形成中的独特作用，建立OTM模型，并在负荷期间注射UCHL3抑制剂TCID。压缩负荷14天，TCID注射后牙齿移动距离明显减小，牙槽骨BV/TV显著降低，张力侧的ALP阳性表面受到抑制。此外，siUchl3敲低MS-BMDM-EXOs中的UCHL3表达后，负荷牙槽骨的BV/TV同样降低，ALP阳性表面也显著受损。这些结果表明，OTM期间MS-BMDM-EXO介导的牙槽骨形成需要UCHL3。
最后，实验探讨了MS-BMDM衍生的外泌体UCHL3调节BMSCs成骨的机制。据报道，UCHL3可以与SMAD1相互作用，SMAD1是一种参与BMSC成骨的经典相关分子。因此，研究人员假设UCHL3可以通过调节SMAD1介导BMSC成骨。为了验证UCHL3和SMAD1之间的相关性，使用TCID和MS-BMDMsiUchl3-EXOs处理BMSCs，发现当UCHL3被敲低时，SMAD1的蛋白水平下调（图3a-c）。然后，在BMSCs中过表达SMAD1，发现其显著逆转了MS-BMDM-EXOs中UCHL3抑制引起的成骨基因表达、RUNX2蛋白（图3d-f）、ALP水平和细胞外基质矿化沉积的下调（图3g、h）。
那么，UCHL3如何调节BMSCs中SMAD1的功能？Alphafold2的蛋白质对接结果显示，UCHL3可以通过氢键直接与SMAD1结合（图3i）。进一步的免疫荧光和免疫共沉淀验证了BMSCs中UCHL3和SMAD1之间的相互作用（图3j-l）。此外，TCID对内源性UCHL3的抑制提高了BMSCs中内源性SMAD1的泛素化水平（图3m），这表明UCHL3可以通过去泛素化提高SMAD1蛋白的稳定性。同时，免疫组化染色实验显示，UCHL3抑制剂TCID降低了牙齿移动小鼠负荷牙槽骨中的SMAD1水平。这些结果表明，SMAD1是MS-BMDM-EXO衍生的UCHL3促进BMSCs成骨所必需的。
研究表明，机械力诱导的巨噬细胞衍生的外泌体UCHL3通过靶向SMAD1促进BMSCs成骨，从而促进OTM期间牙槽骨的形成。
总之，该研究表明，机械力可以改变巨噬细胞衍生的外泌体中的蛋白质组成。外泌体将UCHL3从机械刺激的巨噬细胞转移到BMSCs，提高了BMSCs中的SMAD1水平，这有利于BMSCs成骨，从而促进OTM期间牙槽骨的形成。因此，这些发现从巨噬细胞衍生的外泌体调节BMSCs成骨的角度证明了OTM过程中机械力诱导成骨的机制，这可能有助于开发正畸治疗临床问题的新解决方案。
参考文献：PuP,WuS,ZhangK,XuH,GuanJ,JinZ,SunW,ZhangH,YanB.Mechanicalforceinducesmacrophage-derivedexosomalUCHL3promotingbonemarrowmesenchymalstemcellosteogenesisbytargetingSMAD1.JNanobiotechnology.2023Mar14;21(1):88.doi:10.1186/s12951-023-01836-z.PMID:36915132;PMCID:PMC10012474.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36915132/
图片来源：所有图片均来源于参考文献
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