正畸治疗是通过正畸牙齿移动（OTM）矫正咬合不正。OTM 是一种基于压力-张力理论的机械生物学过程。压力侧的骨吸收是限速步骤，破骨细胞活化在骨代谢中起决定性作用。破骨细胞来源于单核细胞/巨噬细胞造血前体细胞，最终分化为成熟的破骨细胞。在正畸力刺激下，牙周成纤维细胞和成骨细胞释放出一系列细胞因子，间接调节破骨细胞分化。
研究表明，机械刺激可以通过机械敏感受体（包括机械敏感离子通道和细胞粘附分子）直接调节破骨细胞分化。G 蛋白偶联受体（GPCRs）是位于细胞膜表面的受体大家族，与破骨细胞分化和成熟密切相关。GPCRs 可以感知机械力并参与细胞内生物过程。然而，GPCRs 是否通过感应机械力参与破骨细胞生成仍是未知数。
CD97，也被称为 ADGRE5，是一种粘附类 G蛋白偶联受体（aGPCR），这种分子在免疫系统疾病和上皮细胞衍生的恶性肿瘤中的作用已被充分证明，但最近，CD97 的机械感应功能引起了越来越多的关注。然而，CD97 在牙周组织中的表达尚未见报道。此外，正畸力是否会改变 CD97 表达仍不清楚，CD97 是否调节破骨细胞分化或参与 OTM 也尚未阐明。
基于此，河北省口腔医学重点实验室及国家口腔医学中心（四川大学华西口腔医院）的联合团队在一项研究中，使用 OTM 和静态加压应用模型探索了 CD97 表达与破骨细胞分化之间的关系。CD97 被确定为抑制破骨细胞分化和 OTM 的潜在机械感应分子。这些发现将有助于理解 OTM 的机制，并为加速牙齿移动提供潜在的治疗靶点。研究成果发表在 International Journal of Oral Science 期刊题为“CD97 inhibits osteoclast differentiation via Rap1a/ERK pathway under compression”。
首先，分别分析了来自牙周组织和牙槽骨的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据，发现巨噬细胞亚群存在于牙周组织和牙槽骨中，CD97 在两者的单核细胞/巨噬细胞簇中高度表达。
为了研究机械力对 CD97 表达的影响，将小鼠巨噬细胞系 RAW264.7 细胞暴露于 1 g/cm2 的静态压缩 2 小时（图1 a）。Piezo1 的 mRNA 表达上调，表明压缩力施加成功（图1 b）。与对照组相比，CD97 mRNA 表达上调，而其他成员如 Gpr126、Gpr133 和 Gpr114 的表达下调。
此外，还检测了 CD97 在不同受力和时间下的 mRNA 表达水平，发现其表达在 1 g/cm2 和 2 g/cm2 压缩力刺激2 小时下以力依赖性方式上调（图1 c）。在刺激的早期阶段（1、2、4 h），静态压缩应用显著增强了 CD97 mRNA 的表达（图1 d）。通过活性染色将 1 g/cm2 压缩力持续4 小时确定为最佳压缩条件。TRAP染色用于观察和评估破骨细胞生成（图1 e），破骨细胞的数量（图1 f）和 TRAP-阳性细胞面积的百分比（图1 g）在压缩负荷和 RANKL 诱导的破骨细胞生成 7 天后显著降低。
通过 SEM 评估破骨细胞的骨吸收功能（图1 h），与对照组相比，吸收陷窝（resorption pit）形成的数量（图1 i）和面积（图1 j）显著降低。免疫荧光染色证实，静态压缩后压缩负荷上调了 CD97 表达（图1 k、l）。这些数据表明，静态压缩上调单核细胞-巨噬细胞中 CD97 的表达并抑制破骨细胞生成。
接下来，为了探讨 CD97 在正畸压缩下牙周组织巨噬细胞中的表达，实验建立了 OTM 模型，与第3天相比，第7天 OTM 距离显著增加。通过 TRAP 染色，发现破骨细胞的数量从第 0 天到第 7 天增加。以 F4/80 分子为巨噬细胞标志物，检测其在小鼠牙周组织中的表达，CD97+ F4/80+ 巨噬细胞的免疫荧光共定位显示，第 3 天牙周组织中阳性细胞增多。CD97+ F4/80+ 巨噬细胞的数量逐渐减少，与 OTM 距离呈负相关。这表明，在早期正畸力负荷期间，CD97 在牙周组织巨噬细胞中的表达增加。
为了确定 CD97 在破骨细胞形成中的功能，特异性敲低 RAW264.7 细胞中的 Cd97 mRNA。TRAP 染色表明，CD97 的敲低刺激了破骨细胞的分化（图2 a、b）。CD97 的缺失促进了吸收陷窝的形成（图2 c、d）。在 CD97 敲低组中，伪足小体肌动蛋白环（Podosome actin Belt-）阳性破骨细胞的大小和数量增加（图2 e、f）。此外，CD97 的敲低上调了与破骨细胞分化相关的基因的表达（图2 g-j）。
为了确定单核细胞-巨噬细胞中的 CD97 对机械负荷的感应，将 RAW264.7 细胞在 CD97 敲低后暴露于静态压缩，1 g/cm2 的静态加压负荷4 小时后抑制破骨细胞的形成和吸收。敲低 CD97 部分恢复了在压缩下的破骨细胞生成（图2 a、b）。与此一致，破骨细胞吸收功能（图2 c-f）和破骨细胞分化相关基因被恢复（图2 g-j）。这些结果表明，CD97 可能是破骨细胞分化过程中重要的机械敏感受体。
为了确定 CD97 在压缩负荷下抑制破骨细胞分化的机制，对转染阴性对照 shRNA（LV-shNC）和 CD97 shRNA（LV-shCD97）的 RAW264.7 细胞进行了 RNA 测序分析。结果表明，396 个基因上调，176 个基因下调。GO分析显示，上调的基因集在 ERK1 和 ERK2 级联反应中富集。KEGG 分析显示，在压缩刺激下，CD97 敲低的 RAW264.7 细胞中，Rap1 信号通路受到抑制，Rap1a 的表达下调。qRT-PCR 同样证实了 CD97 敲低下调了 Rap1 信号通路的代表性基因表达，如 Rap1a、Epac1 和 Adcy6。
由于 Rap1 的活化通过抑制 ERK 通路在调节细胞功能中起重要作用，而 ERK 通路是破骨细胞分化所必需的，因此检测了巨噬细胞中 Rap1a 和 ERK 的蛋白水平。CD97 敲低下调 Rap1a 水平并上调磷酸化 ERK 表达。在压缩刺激下，CD97 和 Rap1a 蛋白水平升高，磷酸化 ERK 表达降低。CD97 的敲低部分恢复了压缩力下磷酸化的 ERK 表达。这表明，Rap1a/ERK 信号通路介导 CD97 在压缩刺激下对破骨细胞分化的影响。
最后，为了确定 Rap1a/ERK 信号是否参与机械力刺激下的破骨细胞分化，对 RAW264.7 细胞施加静态压缩并添加 Rap1a 抑制剂 GGTI298。结果发现，静态压缩抑制破骨细胞的形成和活性，而GGTI298 恢复了压缩下的破骨细胞的分化和活性（图3 a-d）。Western blotting 显示，磷酸化的 ERK 表达因压缩而下调，并且在 GGTI298 处理后被部分逆转（图3 e）。
然后，实验在 OTM 期间对小鼠单侧第一磨牙施用 GGTI298，发现 GGTI298 注射加速了牙齿移动（图3 f、g），牙周韧带中的 TRAP 阳性细胞也增加（图3 h、i）。这些结果表明，机械力通过 Rap1a/ERK 信号调节破骨细胞分化和 OTM 抑制 Rap1a 可以刺激破骨细胞分化并加速 OTM。
总之，该研究揭示了 CD97 是一种新型机械敏感的 aGPCR，使巨噬细胞能够感知压缩并将此信息与 Rap1a/ERK 信号整合以抑制破骨细胞生成和 OTM（图3 j）。具体来说，CD97 在牙槽骨和牙周组织的单核巨噬细胞中表达。压缩上调 CD97 表达并抑制破骨细胞分化。此外，CD97 介导的机械感觉及其下游 Rap1a/ERK 信号通路对于调节破骨细胞分化和阻碍早期牙齿移动至关重要。这种对压缩如何影响破骨细胞分化的理解可能会对 OTM 中牙周组织的生物反应产生新的机制见解，并最终为正畸治疗提供新的策略。
参考文献：Wang W, Wang Q, Sun S, Zhang P, Li Y, Lin W, Li Q, Zhang X, Ma Z, Lu H. CD97 inhibits osteoclast differentiation via Rap1a/ERK pathway under compression. Int J Oral Sci. 2024 Feb 4;16(1):12. doi: 10.1038/s41368-023-00272-x. PMID: 38311610; PMCID: PMC10838930.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38311610/
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