浅谈预防性疫苗的非临床研究考量|佐剂|免疫|大鼠|抗原|毒理学|预防性疫苗

疫苗类产品的安全性评价是个很大的话题，尽量在一篇文章中能提纲挈领的说清要点。当然，首先要遵循的还是各类指南，NMPA（原SFDA）、FDA、EMA、ICH和WHO出台了很多指导性文件，清单罗列如下。

与传统生物药相比，针对感染性疾病的疫苗最大的不同在于供试品为外源性蛋白或糖类，与人体或动物源成分几乎没有任何同源性。非感染性疾病则相反，如肿瘤疫苗，针对的主要是内源性蛋白或新生抗原，非感染性疫苗的非临床安全性评价不在本次讨论之列。

疫苗主要的毒理学研究终点与小分子化药和传统生物药相似，但也有其特别之处，比如需要考察动物是否产生了预期的特异性免疫反应。除了标准毒理研究，根据疫苗类型和适应症，需要开展额外毒理研究，比如神经毒性和生物分布。此外，对于种属选择、给药方式、非抗原疫苗组分、佐剂、给药装置、注射位点等因素也要予以关注。下文将围绕用于感染性疾病的疫苗非临床评价关注点进行展开。

疫苗的形式

目前应用于非感染性疾病的疫苗多是将整个病原体灭活或减毒的类型。这类疫苗的免疫反应通常比较强，但是也有其缺点，比如产生对非相关抗原的免疫反应、失活疫苗的逆转风险、抗原组分过于复杂等。此外，全病毒或细菌疫苗对于产品的纯度、工艺放大、批间质量一致性也有挑战。因此，疫苗企业开发了亚单位或个体化疫苗。亚单位疫苗仅包括产生预期免疫反应的抗原，包括蛋白、多糖、多糖偶联物、类毒素等，比如乙肝病毒疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、肺炎球菌疫苗等。除了以上，近几年出现了一些新型疫苗形式如核酸疫苗，包括DNA质粒、mRNA或重组病毒载体。其中DNA质粒和重组病毒载体的稳定性较好，mRNA则会被体内的酶降解，需要用脂质纳米粒包裹保护后进行递送。COVID-19的流行为核酸疫苗的快速发展起到了重要推动作用。

抗原

对于灭活的疫苗，抗原通常由病原体表面的各种蛋白质组成。亚单位疫苗的抗原设计则要花点心思，需要结合病原体的生物学、毒力和传染性进行综合考量。通常，决定病原体毒力的部分是比较理想的抗原，比如血凝素、刺突蛋白、失活的细菌毒素。优先选择病原体不同突变株或亚株之间高度保守的序列，确保疫苗能最大范围覆盖尽可能多的病原体。当然，蛋白苗要注意所选择的免疫原的独特性和唯一性，避免选择人体中有相似表位的免疫原。另外，蛋白苗要关注下表达或合成后是否与病原体表面的天然构象具备相同的空间结构，这也是蛋白苗的一个风险。

与蛋白苗不同的是，DNA和mRNA苗递送到体内的是核酸序列。为了保持在血液中的稳定性以及方便细胞摄取，mRNA通常用脂质纳米粒包裹后递送。当然，mRNA疫苗除了将预期的RNA序列放入骨架中，也会加一些非标准核苷，以逃避先天免疫系统的攻击。DNA疫苗的序列通常嵌入质粒或腺病毒中。mRNA也好，DNA也罢，最终都是将外源性蛋白在宿主细胞中表达，并启动人体免疫反应。

佐剂

全病毒或细菌灭活、减毒疫苗，由于其中既包含预期免疫原，也包含很多其它微生物成分，在触发机体先天和后天免疫方面要强于亚单位疫苗的。这就要提到佐剂的作用了。佐剂具备增强抗原的免疫反应、延长作用时间、调节免疫反应类型、保持抗原在注射位点的缓释等作用。

虽然佐剂本身具备免疫刺激作用，FDA和EMA并不认为佐剂属于制剂处方中的活性成分。原因是已上市的疫苗以铝盐佐剂为主，比如氢氧化铝和磷酸铝。这类佐剂已经使用了几十年，已有很充分的安全性信息。不过，对于新型佐剂，安全性信息有限，或尚未有上市产品使用过，需要谨慎对待。不同监管机构对于新型佐剂的评价要求不完全一致。EMA要求新型佐剂原则上要在两个种属中（一个啮齿类、一个非啮齿类）独立开展毒理学研究。WHO则认为只需要在一个毒理研究种属中，额外设置一组佐剂对照组即可。

疫苗非临床研究考量因素

1、供试品

理论上，用于非临床毒理研究的疫苗、佐剂、含佐剂疫苗的批次应该与拟用于临床试验的一致，且应在GMP条件下完成的制备。当然，指导原则也留了一定灵活度。如果同批次样品不易获得，非临床研究用样品应该与临床拟用样品在生产过程、理化数据、制剂和稳定性等方面具有可比性。若是二者之间有明显差异，则需要进行详细的解释说明。这点与传统治疗性生物制品要求类似，强调的还是拟用于毒理研究的样品与临床样品的可比性，并不是严格要求一致。实操过程中，为了保障药物开发进度，通常不会等临床批次样品生产且放行完再启动毒理研究，与临床样品工艺和规模类似的工程批往往是首选。但是，对于生殖毒性研究，由于是在临床阶段平行开展的，建议还是使用临床批次样品。

如果供试品涉及到配制环节，如复融、混合等，需要在给药前进行GLP条件下的供试品分析。但是，由于佐剂的存在，会吸附抗原，导致抗原浓度的分析有很大挑战。疫苗开发企业最好提供预混好，不需要进一步处理的制剂，可以省去供试品分析环节。

关于疫苗的放行，过往大部分药品监管机构要求开展一般毒性/异常毒性等确认是否有外源性有毒污染物。不过，美国和欧洲已经将这些研究内容去掉了，但国内、俄罗斯对这些实验似乎还是有要求。

2、种属选择

疫苗毒理学研究种属选择的核心是动物能否对注射的抗原产生免疫反应。当然，如果所产生的免疫反应与人体类似是最理想的。但实际情况是，动物中的免疫反应，即使非人灵长类，往往是不能转化到临床的。WHO强调，所选择的动物种属一定要敏感。但无论如何，动物所产生的免疫反应跟人体还是有很大不同的。落到实操环节，大部分疫苗在毒理研究种属中会考察下免疫原性。

大鼠和兔子是最常用的疫苗研究用种属，具备体型小、成本低、免疫反应通常还不错的优点。其它种属如小鼠、豚鼠、非人灵长类、犬、小型猪、雪貂等也会考虑。

兔子：兔的免疫反应通常很强，是传统的疫苗毒理学研究用种属。兔可以按照人体给药量（通常0.5mL）实现单点肌肉注射。此外，兔的血量比较多，可以在同一只动物中实现血液学、凝血、血生化、免疫学指标检测。但是，用于检测兔细胞免疫反应的试剂受限，再就是兔的临床病理、组织病理学的历史背景数据也有限。另外，兔被操作时的心脏相关指标变化特别敏感。兔子胆子非常小，很容易受惊或者被吓死，是不是就是与心脏指标过于敏感有关，最后这句纯属猜测啊。

大鼠：相较于兔子，大鼠体型更小，更容易操作，也拥有大量的临床病理、组织病理学背景数据，且各种免疫检测试剂也很容易获得。但临床常用注射体积（如0.5mL）在大鼠中通常是不能单点注射的，一般要注射两个位点。当然，可以基于mg/kg进行种属间剂量换算。另外，大鼠血量有限，不能实现在同一只动物同时考察血液学、凝血、血生化和免疫学检查，会增加参数间结果分析的复杂性。不过，大鼠在化药、治疗性生物制品等产品毒理研究中是主要啮齿类种属。故，很多公司基本也将大鼠作为疫苗毒理研究的主要种属。

小鼠：小鼠在疫苗毒理研究中使用的比家兔或大鼠都要少。不过，很多疫苗的药理学或药效学研究都是采用小鼠开展的，这其实就没有理由拒绝将其作为毒理学研究种属。大鼠有的缺点，小鼠基本都是，包括采血量问题、剂量问题等。

非人灵长类：非人灵长类的体型允许肌肉注射给予完整的人体剂量，且同一只动物血量足够完成所有计划开展的检测。非人灵长类的肌肉可以实现一些特殊的给药装置如电穿孔给药。从伦理角度，只有在没有其他相关动物可用的前提下，才能使用非人灵长类开展毒理研究。疫苗通常是外源性蛋白如来自病毒或细菌的组分，不存在与食蟹猴中蛋白更相似的情况，这点与传统治疗性生物制品如抗体，还是有很大区别的。因此，非人灵长类在疫苗毒理研究中用的不太普遍。

其它非临床研究种属

雪貂因对流感比较敏感，常用于流感疫苗的研究，既作为有效性研究种属，也作为安全性研究种属。豚鼠常用于局部耐受性研究或批放行中的异常毒性研究。小型猪的肌肉支持临床注射剂量，且与人体具备相似的生理学、皮肤结构和免疫学特征。但小型猪的免疫学检测试剂不易获取，限制了其使用。犬对吐温80过于敏感，而吐温80又是疫苗制剂处方中的常用组分，而且犬的背景数据缺乏，免疫学检测试剂也受限。

3、试验组别设计

试验组别至少包括生理盐水对照组（或制剂buffer组）和疫苗组。如果疫苗中含有佐剂，且佐剂未在已上市疫苗中大量使用，则建议加设佐剂对照组。如果佐剂是诸如磷酸铝和氢氧化铝这种已有充分的研究数据且已在大量上市产品中使用，则不需要设置单独的佐剂对照组。每组动物数量，WHO也给出了建议，对于大鼠或者小鼠，每组10雌+10雄即满足要求。啮齿类动物起始年龄在6-8周，兔子年龄在3-4个月。

4、剂量、注射体积及给药部位

疫苗毒理研究理论上允许设置单个剂量水平，各个国家的指导原则均建议采用临床最大拟用剂量给药。比如2023年FDA批准上市的辉瑞的二价呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗ABRYSVO，非临床一般毒理研究选择大鼠240μg/天的单剂量设计（临床最大拟用剂量为240μg/天）。不过，2020年FDA批准上市的Merck的人乳头瘤病毒（HPV）疫苗GARDASIL 9，非临床一般毒理研究选择大鼠低、中、高三剂量的设计。

给药途经应模拟临床拟用途径。大部分疫苗临床使用肌肉注射途径给药，也有皮内、皮下、鼻腔等给药途经。

临床肌肉注射常用体积为0.5mL，对于兔和体型大的动物是没问题的，通常注射在后肢的股四头肌。如果需要多次给药，通常可以左、右侧交替给药。大鼠常用注射部位是股四头肌，后肢的其它肌肉如股二头肌、腓肠肌也可以使用。大鼠和其它啮齿类动物，很难实现单点肌肉注射临床拟用体积，毕竟大鼠肌肉最大注射体积不超过0.2mL。小鼠则更受限，每个肌肉注射位点不超过0.05mL。对于出现无法实现人体剂量给药的情况，可以考虑增加抗原浓度，从而减少给药体积。但是，这种策略并不常见，因为浓度的改变对免疫反应也可能有影响。

皮下给药大部分注射部位在肩胛间区域、颈背侧、肩部或侧面，注射体积可以高达5mL/kg，也可以按照临床拟用剂量和体积给药，倒不会像肌肉注射那般受限。

鼻内给药的疫苗直接将疫苗递送至鼻腔粘膜。通常适用于流感病毒或呼吸系统相关病毒。疫苗鼻内给药的主要优势是既能诱导系统免疫，也能诱导局部/粘膜免疫。与其它给药途经相比，会在局部产生更多的IgA抗体及明显的细胞免疫。另外，鼻内给药无创，不需要针头注射，患者的依从性也会更好。但是，由于不同种属鼻腔生理学差异，大鼠、犬、小鼠并不是合适种属，非人灵长类如食蟹猴是推荐种属。

5、给药次数和给药间隔

给药次数至少要覆盖临床一年内预期给药数量，通常建议N+1次（N为临床给药次数）。

动物毒理研究中的给药间隔通常比临床短，通常2-3周给药1次。但如果临床频率小于2周，临床前也需要模拟同样频率。通常末次药后2-3天处死主试验组动物，2-4周后处理后续恢复期动物。

6、评价指标

疫苗的毒理学评价指标大部分与其它生物制品类似，但也存在需要特别关注的点，包括局部毒性如注射部位反应；免疫反应如体温、急性期反应蛋白及抗原特异性免疫反应等。

局部毒性：建议对疫苗给药后注射位点进行评价，如红斑和肿胀，通常通过评分实现。当然，不只疫苗，通常注射剂都会在重复给药毒性试验中伴随考察局部刺激性，大部分产品没有刺激性发生。但疫苗比较特殊，给药局部有可能会出现免疫反应，所以需要重点关注。

临床病理：疫苗的临床病理检测指标与其它药物的要求大体是类似的，主要包括血液学、血生化、凝血和尿检。当然，也有一些是疫苗这类产品需要特别关注的。比如与疫苗免疫反应相关的指标如急性期反应蛋白，如C反应蛋白（CRP）。CRP是人、兔、犬和猴种属中常用的急性期反应指示蛋白，但是，在啮齿类动物中，这一指标非常不敏感，反而会以α1-acid glycoprotein和α2-macroglobulin替代，所以要关注这些指标的种属间差异。另外，疫苗有引起局部肌肉损伤的风险，可以关注肌酸激酶的变化。纤维蛋白原也是一个能反应机体炎症和急性期反应的标记物，由于其基线浓度比较高（200-300mg/dL），小幅度的变化通常也是有意义的。另外，佐剂由于也是有免疫活性的，局部注射后引发的组织损伤及后续继发的临检指标的变化有时不好区分是疫苗中的抗原引起，还是佐剂引起，这也是为什么新型佐剂要加设佐剂单独对照组的原因。

免疫学检测：免疫学检测是疫苗的重中之重。疫苗选择种属的很重要的一个依据就是该种属对疫苗中的抗原能产生免疫反应，而且最好免疫反应的类型和强度与人体可比。根据所选择种属的血容量，能在毒理主研究组采血最佳，实在血量无法满足要求，可以考虑设置卫星组。采血点最好覆盖给药前、给药结束和恢复期结束。检测指标涵盖细胞免疫和体液免疫。对于亚单位疫苗，如果里面含有多种不同抗原，最好能对每种抗原的免疫反应进行单独检测。

病理学检查：疫苗的注射部位反应是非常常见的，而且与剂量不是特别相关，因此需要对注射位点及周围引流淋巴结进行大体解剖和组织病理学检查。其它大多数组织与常规毒理学研究的要求一致，并无太多特殊之处。

7、遗传毒性和致癌性

疫苗抗原通常是生物制品，遗传毒性通常不需要开展。但是，许多新型佐剂组分中可能含有新的化学成分，则需要对遗传毒性进行考察。疫苗包括佐剂，通常不需要开展致癌性方面的研究。

8、组织分布研究

对于含有核酸成分的疫苗如DNA疫苗，存在DNA整合至宿主基因组的可能，从而提升癌变、基因组不稳定、细胞异常增殖等风险。佐剂成分中含有寡核苷酸如CpGs，也会存在类似担忧。这类产品通常需要开展生物分布研究，探索疫苗核酸组分分布到哪些组织（如血、心脏、脑、肝脏、肾脏、骨髓、卵巢/睾丸、肺、引流淋巴结、脾脏、注射部位组织等），监测时间点从几天到数月不等。检测方法需要有足够的灵敏度、特异性等。RNA疫苗也建议开展。

9、神经毒性研究

许多减毒的病毒疫苗，其活毒是具备潜在的神经毒性的。为确保减毒后，这一风险已经消失，需要对这类疫苗开展神经毒性方面的研究，确定这类疫苗是否在神经组织存在和复制。通常采用猴子开展研究，将病毒疫苗接种到动物丘脑或脊髓内，之后进行17-22天的临床观察，动物安乐死，在对脑、脊髓组织进行病毒特异性的组织病理检查。如果用小鼠、大鼠进行这类试验，最好与监管机构先行沟通。

10、生殖毒性研究

生殖毒性研究的主要目的是评价疫苗或因疫苗产生的免疫反应对胚胎、胎仔是否有影响。关于疫苗的生殖毒性要求在2006年FDA相关指南以及ICH S5（R3）中有介绍，感兴趣的可以去详细了解。如果疫苗有用于育龄妇女、妊娠妇女的可能，则需要在此之前完成发育和生殖毒性相关研究。生殖毒性研究所用供试品建议来自临床拟用批次。所用动物种属类似于常规毒理研究要求，需要对疫苗中的抗原产生免疫反应，啮齿类和兔用的最多。通常仅选择一个种属进行考察即可。剂量方面的考量也类似重复给药毒性研究，一般采用代表临床剂量的单剂量即可。一般选择在动物交配前即开始给药，给药贯穿整个妊娠周期，甚至有企业在动物哺乳期还在给药，以确保动物体内产生足够的抗体滴度和充分的毒性暴露。