皮肤感染是一种常见病，几乎人人都经历过皮肤化脓性感染。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，简称金葡菌）是引起皮肤感染的重要病原菌，临床上约50%的皮肤伤口感染可分离出金葡菌。更重要的是，耐药性金葡菌（如MRSA）感染可大大迟滞了口的愈合，给临床治疗带来巨大挑战。传统的清创、伤口敷料和负压等治疗方法均有一定局限性，如纱布、绷带和棉絮等伤口敷料不能有效杀灭细菌，且频繁更换敷料还会损伤再生组织，推迟伤口愈合。因此，探寻快速促进感染伤口愈合的有效措施仍是临床医学领域的重大课题之一。
已有研究表明，细菌感染伤口微环境通常呈酸性（pH值4.5–6.5），而自组装多肽水凝胶是一种极有吸引力的功能材料，但如何设计成多功能且具有pH响应型的多肽仍然具有挑战性。 基于此，陆军军医大学饶贤才教授、尚伟龙副教授/卢曙光副教授及本论文第一作者刘鹤共同研发了 一系列pH响应型自组装多肽 。其中，多肽L5的序列中同时具有抗炎三肽（KPV）以及pH响应型抗菌活性的motif（FQFL），在中性条件（pH 7.4）下可以自组装形成水凝胶，具有生物相容性；在酸性条件下（pH 5.5）表现出广谱的抗菌活性。L5负载噬菌体内溶素LysSYL（L5@LysSYL）后，可实现内溶素LysSYL在病理条件下的持续缓释，大大提高了LysSYL的稳定性和生物利用度。转录组测序结果揭示了L5@LysSYL可能通过破坏细菌细胞膜、抑制细菌细胞壁形成及延缓细胞分裂等多种协同机制导致细菌死亡。更重要的是，水凝胶L5@LysSYL可通过杀菌、降炎及促进血管生成基因表达等方式促进耐甲氧西林金葡菌（methicillin-resistant S. aureus，MRSA）感染小鼠皮肤伤口愈合，具有良好的临床应用开发前景。相关研究工作以“LysSYL-loaded pH-switchable self-assembling peptide hydrogels promote methicillin-resistant Staphylococcus aureus elimination and wound healing”为题发表在《 Advanced Materials》上。
Scheme 1:pH响应型自组装多肽L5负载内溶素LysSYL（L5@LysSYL）治疗MRSA感染小鼠伤口愈合的示意图。
图1：基于抗菌活性及生物相容性实验筛选自组装多肽。作者利用氨基酸的特性和多肽motif设计了9条自组装多肽，实验证实有6条多肽可以自组装形成水凝胶。对这6条多肽的抗菌活性、生物相容性和溶血活性进行检测，结果L5的生物相容性最好，可用于递送内溶素金葡菌噬菌体内溶素LysSYL。
图2：水凝胶L5的自组装机制和表征。L5在中性条件（pH 7.4）可以通过非共价相互作用（静电、氢键和疏水作用）自组装形成水凝胶，在酸性条件（pH 5.5）下由于静电斥力导致多肽质子化，从而发挥抗菌作用。小瓶倒置法观察显示L5具有pH敏感的成胶特性，圆二色谱结果进一步证实不同pH可以显著影响L5的二级结构。流式细胞仪检测结果证明L5可以穿过金葡菌USA300和铜绿假单胞菌的细胞膜。
图3：水凝胶L5的抗菌活性检测。激光共聚焦和扫描电镜结果进一步证明L5具有pH响应型的抗菌活性，可以通过与细菌细胞膜相互作用导致细菌死亡。此外，L5在酸性条件（pH 5.5）下还具有缓释功能和广谱抗菌活性。由于L5序列中具有一段广谱抗菌活性的Clavanin A多肽motif（FQFL），这可能也是L5具有广谱抗菌活性的重要原因。
图4：水凝胶L5的形貌表征。作者通过冷冻电镜、透射电镜和原子力显微镜观察，揭示了L5在中性条件下（pH 7.4）可以形成均匀交织的三维多孔结构，平均孔径为5.6 µm，这为药物递送提供了适宜的超分子网络。在酸性条件下，由于L5序列中K和H残基的质子化，水凝胶的三维超分子网络结构在酸性条件（pH 5.5）下被拆解和破坏。
图5：水凝胶L5@LysSYL的表征。L5负载内溶素LysSYL后，可以使内溶素LysSYL的热稳定性提高21.7%。流变力学实验结果表明，水凝胶L5负载内溶素LysSYL后的机械性能提高。傅里叶红外光谱结果证实LysSYL的负载没有影响L5水凝胶的结构。冷冻电镜、透射电镜和原子力显微镜表征结果同样证实了L5@LysSYL具有与L5类似的三维多孔网状结构，但L5@LysSYL的平均孔径（22.5 µm）显著大于L5水凝胶（5.6 µm，P<0.01）。在72 h时，L5@LysSYL在pH 7.4和pH 5.5条件下的累积药物释放百分比分别达17.9%和83.6%，表明在感染伤口环境（pH 5.5）条件下，L5@LysSYL具有pH敏感的释放特性。
图6：水凝胶L5@LysSYL的抗菌活性及抗菌机制。作者通过活菌计数法和生长曲线测定，证实L5@LysSYL具有协同增效的抗菌效能。转录组测序结果表明，金葡菌USA300经水凝胶L5@LysSYL处理后，共鉴定出429个差异表达基因，其中187个基因上调，242个基因下调，提示L5@LysSYL水凝胶可能通过多种协同作用机制，如破坏细菌细胞膜、抑制细胞壁形成、延缓细胞分裂等方式导致细菌死亡。
图7：水凝胶L5@LysSYL促进耐药金葡菌感染小鼠伤口的愈合。作者构建了小鼠全层皮肤金葡菌USA300（MRSA）伤口感染模型，评估水凝胶L5@LysSYL促进伤口愈合的潜力。结果发现L5@LysSYL水凝胶治疗组小鼠在第7和14天均显示出最优的伤口愈合效果。定量检测显示，L5@LysSYL水凝胶治疗组的小鼠创面愈合速率最快。在第14天，水凝胶L5@LysSYL处理组的小鼠创面未愈合面积仅为4.9%，显著低于其他处理组。在水凝胶L5@LysSYL治疗14天后，伤口组织的细菌数量降低6个数量级，明显低于LysSYL处理组。L5@LysSYL处理组的细胞因子和趋化因子的变化程度较LysSYL或L5单独处理组更为明显，表明水凝胶L5@LysSYL治疗可加快伤口愈合中由炎症向再生过程转变。
图8：L5@LysSYL水凝胶通过上调参与组织再生的基因表达水平加速伤口愈合。H&E染色结果表示，L5@LysSYL水凝胶处理组在第14天表现出正常的皮肤结构，皮下纤维组织排列有序，炎症基本消失。对胶原沉积量化结果分析显示，在第14天，L5@LysSYL处理组的胶原蛋白沉积比率最高，与正常对照组相当。与PBS处理组相比，经过L5@LysSYL水凝胶处理后，vegf、egf和fgf基因的表达水平显著上调。
图9：实验小鼠皮肤组织的免疫组化染色分析。CD31被认为是血管内皮细胞标记物，通过免疫组织化学染色对新生血管的数量进行分析，发现水凝胶L5@LysSYL处理后CD31表达量明显高于PBS处理组，表明水凝胶L5@LysSYL治疗后创面组织血管新生增强。此外，L5@LysSYL水凝胶处理后，血管内皮生长因子（VEGF）表达量最高，表明水凝胶L5@LysSYL可能促进创伤组织血管的生成与功能重建。
来源：高分子科学前沿
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