植物天然产物富含具有多种生物功能的化合物。一些提取物具有抗肿瘤药理作用，可以作为耐药性的调节剂。白术内酯 I (ATL-I) 是白术根提取物中的主要活性化合物之一，具有多种药理作用，包括抗炎和抗肿瘤作用。然而，ALT-1是否对肾细胞癌具有抗肿瘤和抗血管生成作用尚不清楚，需要进一步研究以确定ATL-I的潜在抗癌作用。
2024年10月30日，华中科技大学同济医学院同济医院肿瘤科刘博/袁响林教授团队在Autophagy上在线发表了题为”Atractylenolide I inhibits angiogenesis and reverses sunitinib resistance in clear cell renal cell carcinoma through ATP6V0D2-mediated autophagic degradation of EPAS1/HIF2α“的文章。
摘要
肾透明细胞癌（ccRCC）与VHL （von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子）突变和血管生成失调密切相关。越来越多的证据表明，消除肿瘤血管生成的抗血管生成治疗可使ccRCC患者获得更长的无病生存期。白术内酯 I（ATL-I）是白术提取物中的主要活性化合物之一，具有多种药理作用，包括抗炎和抗肿瘤作用。在本研究中，我们揭示了ATL-I在ccRCC中具有强大的抗肿瘤活性。ATL-I通过抑制EPAS1/ hif2 α介导的VEGFA在vhl缺陷的肾透明细胞癌中表现出强大的抗血管生成能力，并通过上调atp酶亚基ATP6V0D2 （ATPase H+转运V0亚基d2）促进EPAS1的自噬降解，从而增加溶酶体功能，促进自噬体与溶酶体之间的融合。机制上，ATP6V0D2直接与RAB7和VPS41结合，促进RAB7- hops相互作用，促进SNARE复合体组装和自噬体-溶酶体融合。此外，在巨自噬/自噬的后期阶段，ATP6V0D2通过增加溶酶体的酸化和活性促进自噬溶酶体降解。此外，我们发现ATL-I可以降低舒尼替尼耐药细胞中上调的EPAS1水平，从而逆转舒尼替尼耐药。综上所述，我们的研究结果表明ATL-I是一种强大的抗血管生成和抗肿瘤的先导化合物，在ccRCC治疗中具有潜在的临床应用价值。
1.ATL-I抑制RCC细胞的增殖、迁移和侵袭
白术内酯是一种从白术中提取的化合物，已知有三种不同的变体：ATL-I、ATL-II和ATL-III。其中，ATL-I已被公认具有优越的抗肿瘤疗效（图1A）。我们的初步评估集中在ATL-I对人肾小管上皮细胞（HK-2）和三个肾癌细胞系（ACHN， 786O和OSRC2）增殖的影响。细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测不同剂量ATL-I作用48 h后细胞活力的变化；HK2、ACHN、OSRC2和786O的计算出的半最大抑制浓度分别为657.4 μM、285.7 μM、125.0 μM和75.77 μM（图1B）。ATL-I对ACHN细胞的抑制作用相对较弱，而对786O和OSRC2细胞的抑制作用较明显（图1C）。为进一步研究ATL-I的抗肿瘤活性，将ATL-I处理细胞48 h后进行EdU实验。我们的观察表明，ATL-I显著阻碍了786O和OSRC2细胞的增殖（图1D）。ATL-I对RCC细胞尤其是ccRCC细胞的选择性杀伤作用强于对正常肾小管上皮细胞。检测ATL-I对肾癌细胞侵袭和迁移能力的影响。利用伤口愈合和Matrigel transwell实验，我们观察到ATL-I显著减弱了786O和OSRC2细胞的迁移和侵袭能力（图1E，F）。此外，我们检测到了与间充质上皮转化相关的标志物的变化。ATL-I给药导致CDH2/ n -钙黏蛋白和VIM（波形蛋白）水平显著降低，同时导致TJP1/ZO-1表达增加（图1G）。
图1 ATL-I呈剂量依赖性抑制肾癌细胞增殖、侵袭和迁移
2.ATL-I诱导细胞周期阻滞和凋亡
之前的研究表明，ATL-I能有效抑制膀胱癌细胞的增殖，主要是通过诱导细胞周期阻滞在G2/M期来实现的。在此基础上，我们研究了ATL-I的生长抑制作用与细胞周期调节之间的潜在联系。ATL-I处理导致处于S期的786O和OSRC2细胞的剂量依赖性增加，同时伴有G0-G1和G2-M期细胞比例的相应减少（图2A）。此外，我们发现ATL-I可以剂量依赖性方式触发细胞凋亡（图2B）。与对照组相比，ATL-I处理的细胞中促凋亡蛋白cleaved caspase 3 （caspase 3）和BAX显著上调。相反，在atl - i处理的细胞中，抗凋亡蛋白BCL2的表达显著减少（图2C）。考虑到ATL-I作为一种传统中药的作用，并且有证据表明ATL-I对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT-MTOR、MAPK和NFKB/NF-κB信号通路有影响，在atl - i处理组中，MTOR、PI3K、磷酸化AKT和MAPK蛋白水平显著下调（图2C）。为了更准确地评估ATL-I在类似ccRCC生物学和临床背景下的治疗效果，我们建立了一个原位异种移植模型。尸检结果显示，与对照组相比，ATL-I （50 mg/kg）治疗组的肿瘤体积显著减小（图2D）。相应地，在ATL-I治疗后，MKI67表达显著下降（图2E）。
图2 ATL-I抑制ccRCC细胞周期进程并诱导细胞凋亡
3.ATL-I在体内的抗血管生成作用
为了进一步探索ATL-I的抗肿瘤机制，我们进行了全面的转录组分析，比较了ATL-I治疗组和对照组的基因表达谱。对两组间差异表达基因进行KEGG和GO分析。通过KEGG通路分析，我们发现ATL-I治疗与多个癌症相关信号通路显著相关，如MAPK， PI3K-AKT和HIF1A/HIF1α（缺氧诱导因子1亚基α）-ARNT/HIF1β（芳烃受体核转位蛋白）异源二聚体（HIF-1）信号通路。HIF-1是一种重要的转录因子，是氧稳态的中枢调节因子。在低氧条件下，HIF-1调控了广泛的低氧诱导基因的表达，从而确保细胞适应和存活。有趣的是，HIF1A-EPAS1通路之前未被报道与ATL-I相关（图3A）。GO分析进一步表明，ATL-I治疗与血管生成密切相关，尤其是在血管系统发育的调节方面（图3B）。为了验证这些结果，我们研究了ATL-I在体外和体内的抗血管生成作用。我们观察到ATL-I在160 μM浓度时表现出更强的阻止HUVEC管形成的活性，与贝伐珠单抗（50 ng/ml）产生的效果相似（图3C）。此外，鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）和Matrigel plug两种血管生成模型的结果证实了ATL-I在体内的抗血管生成能力。CAM实验证实ATL-I可以有效抑制新生血管的形成（图3 3D）。在Matrigel胶塞试验中，将混合了786O细胞（有或无ATL-I）的Matrigel胶皮下植入小鼠体内（图3E）。含有ATL-I的栓子显示血管生成显著减少（图3F）。IHC染色显示，ATL-I治疗导致VEGFA生成显著减少（图3G），而VEGFA是肿瘤血管生成的关键驱动因素。如PECAM1/CD31染色减少所示，VEGFA表达减少与肿瘤血管生成受到显著抑制相关（图3H）。
图3 ATL-I在体内外均可抑制血管生成
4. atl -i诱导的ATP6V0D2上调通过自噬途径加速EPAS1的降解
比较对照组和ATL-I组HIF1A-EPAS1-VEGFA-KDR信号通路组分的mRNA水平。如图4A所示，ATL-I强烈抑制了786O和OSRC2细胞中VEGFA mRNA的转录。然而，在ATL-I治疗组和对照组之间，HIF1A/HIF1α和EPAS1 mRNA表达水平相似（图4A）。考虑到HIF1A和EPAS1在VEGFA的产生中起关键作用，我们进一步检测了对照组和ATL-I组中HIF1A和EPAS1的蛋白表达。结果表明，在ATL-I组中EPAS1蛋白表达显著降低，提示ATL-I可能通过翻译后修饰调控EPAS1的表达（图4B）。此外，ATL-I处理缩短了786O细胞中EPAS1蛋白的半衰期，这与在OSRC2细胞中的发现一致（图4C）。ATL-I可能通过促进EPAS1的降解而导致肾透明细胞癌中VEGFA的下调。Western blot结果显示，与对照组相比，在MG132存在的情况下，ATL-I组EPAS1蛋白表达明显降低（图4D），提示另一条非蛋白酶体依赖性的降解途径可能参与了ATL-I介导的EPAS1降解。因此，我们在溶酶体抑制剂氯喹的存在下孵育786O和OSRC2细胞，观察到对照组和ATL-I组的EPAS1和SQSTM1/p62表达水平相似（图4E）。这些结果表明，ATL-I可能通过MTOR通路抑制以外的机制促进自噬。
为了进一步研究ATL-I调控EPAS1自噬降解的机制，我们在RNA-seq数据集中筛选了自噬相关的差异表达基因。ATP6V0D2是继ATL-I治疗后第二大上调的基因，它引起了我们的关注，因为有报道称其与溶酶体功能相关（图4F）。在786O和OSRC2细胞中，RT-qPCR和western blot分析证实了atl -i诱导的ATP6V0D2的剂量依赖性上调（图4G）。ATL-I可能通过激活ATP6V0D2来加速EPAS1的降解。我们观察到，ATP6V0D2缺失在很大程度上逆转了ATL-I诱导的EPAS1和VEGFA表达下调（图4H）。放线菌酮试验进一步证实，ATP6V0D2下调增强了EPAS1蛋白稳定性（图4I）。氯喹治疗消除了ATP6V0D2耗竭引起的EPAS1蛋白表达增加（图4J）。接下来，我们使用LysoTracker Red标记溶酶体，研究ATP6V0D2是否会影响EPAS1在溶酶体上的定位。使用MG132阻断蛋白酶体降解途径后，EPAS1与溶酶体的共定位增强。然而，与对照组相比，ATP6V0D2敲低大大降低了EPAS1与溶酶体的共定位（图4K）。
图4 ATL-I上调ATP6V0D2可加速EPAS1的自噬降解
5.ATP6V0D2抑制ccRCC的增殖、侵袭和转移
从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas， TCGA）数据库检索的数据显示，在ccRCC患者中，ATP6V0D2表达显著下调（图5A）。与ATP6V0D2表达水平高的患者相比，ATP6V0D2表达水平降低的患者的总生存期、无进展生存期和疾病特异性生存期显著较差（图5B）。12对肿瘤和瘤周组织蛋白表达的IHC分析证实，肿瘤组织中的ATP6V0D2显著减少（图5C）。功能分析表明，在786O细胞中过表达ATP6V0D2可显著降低细胞增殖、迁移和侵袭，而敲低ATP6V0D2可产生相反效果（图5D-G）。此外，ATP6V0D2过表达使786O细胞凋亡率增加了10%（图5H）。此外，这些发现在体内得到了验证。ATP6V0D2的过表达导致肿瘤体积明显减小，而ATP6V0D2的敲低导致肿瘤体积增大（图5I）。PECAM1免疫组化染色结果显示，oe ATP6V0D2组血管数量减少，sh-nc组血管数量增加（图5J）。综上所述，上述结果表明ATP6V0D2通过调节EPAS1的表达来抑制肾癌的进展。
图5 ATP6V0D2抑制肾癌的增殖、侵袭和转移
6. ATL-I通过ATP6V0D2介导促进自噬体-溶酶体融合和溶酶体功能
透射电子显微镜（TEM）分析显示，与对照组相比，ATL-I处理后每个细胞的自噬体数量显著减少。相反，当ATP6V0D2被敲低时，我们发现了相反的结果（图6A）。Western blot分析表明，ATL-I对LC3-II和SQSTM1的表达水平有抑制作用（图6B）。然而，ATP6V0D2缺失显著抵消了这一影响（图6C）。为了进一步证实这一点，我们用雷帕霉素诱导sh-nc和sh-ATP6V0D2细胞自噬。与此一致，在sh-nc组中，SQSTM1和LC3-II随着时间的推移迅速降解，而在sh-ATP6V0D2组中变化不大（图6D）。雷帕霉素可增强sh-nc和sh-ATP6V0D2细胞中LC3-II的表达。然而，氯喹治疗后，两组的SQSTM1和LC3-II水平相似（图6E）。以上结果表明，ATP6V0D2在不影响自噬体形成的情况下促进了自噬流。此外，我们使用rfp - gfp标记的LC3进行了详细的定位检查。GFP的荧光被溶酶体的酸性pH抑制，从而能够区分自噬体（GFP+和RFP+：黄色）和自噬溶酶体（GFP -和RFP+：红色）。敲低ATP6V0D2导致RFP+-GFP+-LC3黄色点状结构的数量增加，这表明ATP6V0D2并没有阻碍自噬体的形成，但却显著影响了自噬体的降解过程（图6F）。而当自噬体和溶酶体融合被氯喹阻断后，RFP+-GFP+-LC3黄色点状结构的数量在两组间差异无统计学意义（图6F）。
考虑到ATP6V0D2是液泡型H±ATPase（V-ATPase）的组成部分，我们推测它可能参与V-ATPase介导的溶酶体酸化。沉默ATP6V0D2消除了ATL-I诱导的溶酶体酸化和活性增加（图6G，H）。CTSB（组织蛋白酶B）和CTSD（组织蛋白酶D）是两种主要的溶酶体水解酶，它们的成熟需要溶酶体酸化。我们发现，ATP6V0D2敲低在很大程度上逆转了ATL-I治疗后CTSB和CTSD的增加（图6I）。
图6 TL-I通过ATP6V0D2促进自噬体-溶酶体膜融合和溶酶体功能
7.ATP6V0D2促进RAB7-HOPS相互作用并促进SNARE复合体的组装
自噬的完成不仅受溶酶体活性的调节，还受自噬体-溶酶体融合进程的调节。因此，我们还评估了ATP6V0D2是否参与了自噬体和溶酶体的融合。对点状自噬体标记（LC3）和溶酶体标记（LAMP1）的共聚焦共定位分析显示，ATL-I对自噬体和溶酶体融合的促进作用也可以被ATP6V0D2敲低逆转（图7A）。为了阐明ATP6V0D2如何阻断自噬体和溶酶体的融合，我们通过免疫沉淀和质谱分析了ATP6V0D2结合蛋白。我们发现ATP6V0D2和RAB7之间存在强相互作用，可调节细胞膜运输（图7B）。我们进一步探索了ATP6V0D2在自噬体-溶酶体融合过程中是否与RAB7和HOPS （VPS41和VPS39）相互作用。在786O细胞中，我们发现flag标记的ATP6V0D2与RAB7和VPS41结合（图7C）。此外，通过GST亲和力-分离试验证实了两者的直接相互作用（图7D）。此外，免疫共沉淀实验表明，敲低ATP6V0D2降低了RAB7和VPS41之间的相互作用（图7E）。因此，ATL-I治疗显著促进了这一过程（图7F）。ATP6V0D2与RAB7和VPS41结合，作为重要的桥梁促进RAB7- hops相互作用，从而增加自噬体-溶酶体融合。此外，它还增加了STX17和VAMP8之间的相互作用，促进了自噬体-溶酶体融合。此外，它通过增加溶酶体的酸化和活性来促进自噬溶酶体降解（图7G）。
图7 ATP6V0D2促进RAB7-HOPS相互作用并促进SNARE复合体的组装
8.ATL-I通过抑制EPAS1通路增强肾透明细胞癌对舒尼替尼的敏感性
舒尼替尼是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，已成为晚期肾癌患者的主要治疗模式。建立了舒尼替尼耐药细胞株SU-R-786O。值得注意的是，SU-R-786O细胞暴露于舒尼替尼后，与野生型786O细胞相比，细胞存活率显著增加（图8A）。与之前的研究结果一致，与野生型细胞相比，EPAS1和VEGFA在SU-R-786O细胞中显著上调（图8B）。有趣的是，ATP6V0D2的表达在SU-R-786O细胞中显著下调（图8B）。ATL-I上调ATP6V0D2表达，导致EPAS1降解。因此，我们探讨了ATL-I能否通过降低EPAS1的表达逆转ccRCC细胞对舒尼替尼的耐药。CCK8检测结果显示，与WT-786O相比，SU-R-786O经舒尼替尼处理后细胞活力显著增加。然而，当联合ATL-I处理时，WT-786O和SU-R-786O细胞对舒尼替尼的敏感性无显著差异（图8C）。细胞凋亡实验结果也证实了上述结果（图8D）。与体外结果一致，ATL-I联合治疗显著逆转了SU-R-786O细胞对舒尼替尼的耐药性（图8E、F）。联合用药组mki67阳性细胞数、肿瘤血管面积及EPAS1表达均明显减少。此外，tunel阳性细胞比例显著增加（图8G）。综上所述，这些发现表明ATL-I可以通过atp6v0d2介导的EPAS1-VEGFA通路抑制SU-R-786O细胞对舒尼替尼的敏感性。ATL-I联合舒尼替尼对缓解舒尼替尼获得性耐药具有协同作用。
图8 ATL-I通过抑制EPAS1通路增强肾透明细胞癌对舒尼替尼的敏感性
结论
综上所述，我们的研究表明ATL-I具有靶向各种癌症相关通路的能力，从而阻碍ccRCC的进展。ATL-1通过抑制EPAS1-VEGFA信号轴发挥重要的抗血管生成作用。机制上，ATL-I通过上调ATP6V0D2增加溶酶体活性，促进自噬体与溶酶体融合，从而促进EPAS1的自噬降解。此外，我们发现EPAS1的过度活化是ccRCC对舒尼替尼耐药的可能机制，而ATL-I部分逆转了这种耐药。因此，我们的研究支持ATL-I作为ccRCC治疗的潜在抗肿瘤先导化合物。
Li Q, Zeng K, Chen Q, Han C, Wang X, Li B, Miao J, Zheng B, Liu J, Yuan X, Liu B. Atractylenolide I inhibits angiogenesis and reverses sunitinib resistance in clear cell renal cell carcinoma through ATP6V0D2-mediated autophagic degradation of EPAS1/HIF2α. Autophagy. 2024 Nov 4:1-20. doi: 10.1080/15548627.2024.2421699.
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