【导读】组合siRNA的使用在药物发现方面显示出巨大的潜力，但识别安全有效的siRNA组合仍然是一个挑战。在这项研究中，团队开发了一种大规模多重技术，用于系统筛选基于siRNA的鸡尾酒疗法。
2024年11月19日，香港城市大学生物医学工程学系史鹏团队在期刊《Nature Communications》上发表了题为“Single-cell encoded gene silencing for high-throughput combinatorial siRNA screening”的研究论文。在筛选抗癌siRNA鸡尾酒时，团队们测试了1,300多种siRNA组合，针对与肿瘤生长相关的多个基因进行敲低，发现了有效的3种siRNA配方，特别强调了抑制Cyclin D1和survivin的关键作用以及它们的互补目标，以实现协同效应。这种方法使得大规模siRNA筛选所需的时间和成本大幅减少，并且解决了现有方法不允许的siRNA药理学的关键见解。
https://www.nature.com/articles/s41467-024-53419-7
关于小干扰核糖核酸
01
小干扰核糖核酸（siRNA）是短的双链RNA序列，它们在被引入到细胞质后会与目标信使RNA（mRNA）结合，通过一种称为RNA干扰（RNAi）的过程发挥作用，导致目标mRNA断裂/降解以阻止其翻译，从而抑制基因表达。迄今为止，美国食品和药品监督管理局（FDA）仅批准了5种基于siRNA的治疗方法：patisiran、givosiran、lumasiran、inclisiran和vutrisiran。
这项工作旨在通过开发一种高通量技术，以大规模多重、定量和系统的方式筛选基于siRNA的鸡尾酒疗法，来满足未得到满足的需求。团队识别了最有效的3种siRNA组合作为潜在的抗癌疗法，强调抑制Cyclin D1和survivin的关键作用，以及它们的互补基因靶标，以实现协同合作。
组合siRNA鸡尾酒的筛选
02
多个siRNA在基因沉默方面，比单一siRNA更有效。随着siRNA转染沉默的基因数量增加，从1个到最多5个siRNA，细胞凋亡分别增加了25.80 ± 3.21%，34.10 ± 1.64%，45.12 ± 6.37%，52.45 ± 5.97%和55.35 ± 10.04%（平均值±标准差）。同样，细胞增殖也与siRNA数量呈负相关，随着siRNA转染从1增加到5，细胞增殖抑制了16.67 ± 1.41%，24.71 ± 1.06%，30.40 ± 5.16%，40.34 ± 2.39%和40.64 ± 4.61%（平均值±标准差）。这些发现表明，多个协同siRNA在诱导期望的基因抑制和相关细胞反应方面更有效。当同时转染4个或更多siRNA时，只有边际的抑制效果增加，这表明如果用这6个选定的基因进行癌症治疗，可能存在用于鸡尾酒治疗的最佳siRNA数量。
siRNA鸡尾酒的组合筛选，以评估抗肿瘤效果。
扩展大规模筛选
03
尽管不同Knock-combos的凋亡水平有所不同，但可以清楚地观察到多途径敲低，比仅针对单一途径更有效。这种协同效应在3个siRNA组合中表现得尤为明显，这与团队在之前小规模筛选中的观察结果一致，并强调了高通量组合siRNA筛选创新的重要性和优势。对于所有1,315个siRNA Knock-combos，团队使用K-means聚类分析发现了两个不同的聚类，其中一个显示出明显更好的诱导凋亡效果。团队得出了一个相对比例，以显示每个聚类中单个siRNA的富集情况（聚类1、2），显示Cyclin D1、survivin、HER2、Hsp 27、UPAR和GSK 3a在凋亡促进聚类（聚类1）中的前6个主导作用，这些在前2个凋亡促进Knock-combos中得到了很好的体现。作为枢纽基因，HER2或Cyclin D1显示出与其它基因最多的连接，表明针对补充基因的siRNA的重要贡献。另一方面，uPAR基因似乎是许多主要siRNA的最佳沉默伙伴，无论是针对survivin还是HER2。这些筛选结果为构建用于抗肿瘤目的的组合siRNA治疗，提供了宝贵的见解。
针对20个基因的由1个、2个或3个siRNA组成的1,315种Knock-combos的扩展筛选。
总结
04
1. 本研究开发了一种高通量技术，使用对近红外光和磁场有响应的多层次功能化纳米/微复合载体（Knock-beads），筛选基于siRNA的鸡尾酒疗法，。
2. 该技术通过光穿孔和PDDA层的光热效应实现siRNA的装载和释放，并通过金纳米棒精确控制激光能量。微尺度Fe3O4珠子作为Knock-beads的主干，便于后续成像解码，且不太可能被细胞内吞。通过磁固定、化学交联和尺寸限制，确保Knock-beads与细胞稳定结合，实现单细胞基础的编码和解码。
3. 该技术能够显著提高siRNA组合筛选的通量，通过光谱编码方法实现更高级别的多路复用。
4. 该研究为siRNA鸡尾酒疗法的开发提供了新的方向，有助于加速siRNA基础治疗的开发和临床应用。
参考资料：
1.Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in. Nature 391, 806–811 (1998).
2.Hamilton, A. J. et al. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286, 950–952 (1999).
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