从解剖和生理学角度，猪的心血管系统、泌尿系统、皮肤和消化系统与人体非常相似。其实，猪用于药物有效性、药代动力学、毒性及医疗器械评价已有数十年。只不过，传统的家猪体型相对较大，使用受限，后来开发了较小的品种，即小型猪，操作更容易，也更安全，而且饲养成本更低，供试品用量更少。常见小型猪品系包括Yucatan、Hanford、Sinclair、Gottingen。也有企业开发了基因编辑小型猪，使其携带人重链γ1、γ4和轻链κ，期望降低对全人源或人源化抗体的免疫原性风险。
与犬和非人灵长类动物如食蟹猴相比，小型猪在非临床药物开发过程中的使用非常受限，大多用于经皮给药研究。早在2010年就开始有很多研究建议考虑采用小型猪作为非临床毒理研究的非啮齿类种属，替代犬或者非人灵长类动物。直至2014年，小型猪使用比较多的场景还是局限在小分子经皮给药或心血管安全性研究。小型猪在生物药领域中的应用局限性主要包括缺少背景数据，缺少试剂或生物标记物，免疫系统表征不充分，发育毒性研究的适用性差等。不过，2020年的一项调查显示，80%的企业会考虑将小型猪纳入小分子药物非临床安全性测试的非啮齿类种属，相当比例的企业在生物药项目中也会考虑小型猪的使用。尤其随着COVID-19的出现，非人灵长类供应和价格出现问题，使用起来不如过往方便，导致小型猪的声音越来越多。2022年，FDA甚至专门出台一项指导原则，里面提到，如果科学合理，一般毒理研究可以考虑非人灵长类以外的非啮齿类种属。而且，从动物伦理角度，小型猪较非人灵长类，也应该优先使用。
那小型猪目前的使用情况是什么样的呢？最新数据来自Lilly、BMS、GSK、Pfizer等公司2024年在《Opportunities and challenges for use of minipigs in nonclinical pharmaceutical development: Results of a follow-up IQ DruSafe survey》一文中披露的2017-2022年的调研，收集了来自21家企业的反馈，约50%的企业在药效学研究中用过小型猪，超过75%的企业在PK和毒理中用过（这一数字超过Colleton等人2016年披露的50%）。如果按照药物形式分类，小型猪在小分子中使用最多，多肽/小蛋白次之，大蛋白/抗体药最少，如下图所示。
小型猪使用面临的最大挑战和担忧排序如下图所示，分别是相对较多的供试品需求、缺少特定试剂（如免疫毒性、分子病理学或其他探索性研究）、缺少毒理生物标记物、历史背景对照数据不足等。
以供试品用量为例，完成剂量探索和IND enabling研究，采用Gottingen小型猪的用量较比格犬高60%。而且，如果开展更长周期毒理研究，比如9个月，这一数字会更大，小型猪供试品用量是比格犬的2倍，因小型猪较比格犬体重增加的快。当然，对于很多项目来讲，供试品用量并不是问题，因为更长周期毒理启动时，已经制备了支持临床开发的足够样品量，足以满足小型猪安全性研究的用量。而且，已经有团队在开发可商品化的体型更小的小型猪，主要通过选择性育种、特定饮食或基因修饰如敲除生长激素相关基因等方式实现。
关于试剂、方法和生物标记物，很多公司已经在开发和验证可用于小型猪的试剂和方法。尤其拟用于免疫调节终点评价的试剂，作为大分子蛋白药物免疫毒性评价所需，是开发的重点领域。其实这个问题解决起来并不困难，只是需要时间。过往开发试剂的目标是兼容犬和非人灵长类，随着小型猪使用的增加，自然会投放更多的资源匹配这个种属。
历史背景对照数据的缺乏也是相对的，肯定不如犬和食蟹猴这类种属丰富。但其实已经有一些文献和资料对小型猪的背景组织病理病变、临床病理等进行过披露。不只毒理，包括小分子和生物药的PK表征、PBPK模型也有团队进行了研究。而且，在Fc受体介导的相关作用方面，小型猪与人体之间的转化效果还不错，对于抗体类药物在小型猪的毒理评价提供了更多支持。再者，如果涉及到幼龄动物毒理试验，小型猪也有自己的优势，一是比犬或猴窝仔数更多，降低了对怀孕母体数量要求；二是性成熟更快，约4-7个月；三是体型更大，方便进行某些操作。另外，小型猪在解剖、生理方面与人体相似度更高，因此被广泛用于多种人类疾病的研究，如心血管、代谢、皮肤、免疫或胃肠道疾病。目前，国际上已经有团队将猪心脏移植到人体的案例，猪皮肤的人体异种移植更是多见，也间接说明与人体组织器官的相似性。所以，随着小型猪在各个领域的使用增加，背景数据的问题也会逐渐得以缓解。
小型猪用于蛋白或抗体药物还有一项挑战。由于大分子在小型猪体内几乎不能从胎盘转运到胚胎/胎儿，使得生殖毒性研究出现困难。解决路径有3个，一是评估下候选分子在啮齿类或兔子中的活性；二是如果啮齿类动物不是相关动物种属，可以考虑基因工程改造的啮齿类动物开展研究，如靶点人源化小鼠；三是可以考虑采用替代分子。
来自GSK的 Richard Haworth提到监管机构很早之前已经提倡将小型猪作为非啮齿类研究种属选择之一。小型猪在解剖、生理和生化等方面与人体的相似性，证明作为毒理研究是合适的。虽然由于各种原因，对小型猪的使用尚存偏见，使用频率不如犬或食蟹猴。但是，GSK选择毒理种属是基于证据权重分析的科学合理性，并无默认种属一说，每个分子均按照case-by-case原则评估。主要从7个方面综合评估相关种属选择的科学性和合理性，分别是：1）与人体相比的靶点同源性和组织特异性分布；2）PD反应，比如靶点亲和力和功能等；3）药物暴露；4）代谢特征，比如体外代谢产物相似性；5）生理学和毒理学的人体相关性，比如某些化合物可引起犬急性组织胺释放，不适合选择该种属；6）特定试验的特殊考量和动物福利，如操作可行性；7）历史背景数据，这点并非决定性因素。
分享几个小型猪作为非临床研究种属的案例
案例一：一款抗动脉粥样硬化小分子新药，通过增加高密度脂蛋白（HDL）合成发挥作用，起初选择比格犬作为非啮齿类研究种属。在一项2周犬DRF试验中，发现肾上腺皮质萎缩，后来发现是由于犬缺少低密度脂蛋白-胆固醇所致，故犬不适合用于该类药物毒性评估。理所当然的，食蟹猴成为第一选择。但是，供试品在食蟹猴中的暴露量过低，达不到临床拟用有效暴露。Gottingen小型猪作为第三替补才被派上了用场，经过体外代谢、药理学评估（主要考察是不是低密度脂蛋白作为主要的胆固醇载体）、体内血浆暴露等三道关卡，成功转正，作为该药物的毒性和安全药理学研究种属，并最终获得监管机构批准。
案例二：一款小分子药物，最初选择比格犬、食蟹猴、Gottingen小型猪作为非啮齿类种属进行口服PK研究，生物利用度分别为23%、3-7%、18%，故犬和小型猪被用于进一步非临床评价。不过，口服无法达到临床拟用暴露的特定倍数，转而采用静脉给药途径。在短期IV输注给药试验中，犬出现了Cmax依赖的耐受性问题，主要体现为呕吐，使得对于该种属能否用于更长周期毒理研究增加了担忧。反观“二师兄”，重复IV给药，不仅暴露量较犬高，而且耐受性良好，顺理成章成为非啮齿类最佳种属。最后成功获得FDA IND批准。
案例三：一款双功能长效胰岛素/PCSK9抑制剂产品（LAI-PCSK9）。由于基线脂质水平和血浆脂质组成与人体相似性，起初选择食蟹猴作为非啮齿类相关动物种属。不过，本品经SC给予食蟹猴后，出现药理作用放大的剂量限制性毒性，主要体现为严重低血糖，而且是在暴露量未达人体拟用暴露的情况下发生的，故二师兄再次救场。后续试验发现，小型猪给予LAI-PCSK9后出现血糖和LDL降低，证明是相关动物种属，而且可以耐受更高的剂量和暴露量。所以，本品后续非临床毒理研究，非啮齿类种属选择了小型猪。
案例四：一款非肿瘤适应症重组蛋白产品，体外和ex vivo数据发现，Gottingen小型猪是药理学相关种属，且活性与人、大鼠和食蟹猴相似（未测试犬，可能考虑本品为蛋白药物的原因），故小型猪作为非啮齿类首选。后续研究证明，ADA仅在少量动物中出现，且不影响暴露和药理作用发挥。其它试验如心血管安全药理、溶血、免疫表型研究等均顺利开展。而且，在小型猪中发现了与人体相关的镜检结果异常，大鼠中反而未见。不过，本品申报后，EMA和FDA均对小型猪是不是最敏感种属提出了疑问。最后通过文献资料的总结，支持小型猪是最敏感种属这一结论，并被监管机构接受。
案例五：寡核苷酸类药物非临床研究大动物种属通常选择猴。有团队采用4款非临床和临床安全性特征已经明确，且前期非临床研究采用食蟹猴作为大动物种属的单链寡核苷酸药物进行了研究。试验在Gottingen小型猪开展，设计与之前食蟹猴一致。结果发现，小型猪在TK暴露（包括外周血、肝脏、肾脏等）、耐受性、凝血及补体反应、毒性表现等方面，与食蟹猴大体相似。将小型猪作为单链寡核苷酸药物的非临床大动物种属并无障碍。
最后
其实，二师兄就是吃的多点，长得快点，需要更多供试品，背景数据和一些检测试剂少点，都不算作“致命伤”，但也有其自身的优势，心血管、代谢、皮肤、免疫或胃肠道疾病与人体相似性自不必说，价格和供应优于猴，免疫反应如ADA或过敏潜在优于犬，即使不作为优先选择，至少基于科学、合理角度，给予客观、公平的对待。从目前趋势看，其实也是个机会，搭建小型猪研究平台，积累研究数据，建立先发优势，未来派上用场的可能性在逐渐增加。
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