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导读
β-羟基丁酸（BHB）是一种丰富的酮体。迄今为止，所有已知的BHB代谢途径都涉及BHB和初级能量中间体的相互转化。本研究通过BHB和游离氨基酸的CNDP2依赖性酶结合，鉴定了一种以前未描述的BHB次级代谢途径。这种BHB旁路途径产生一个抗肥胖酮代谢物家族，即BHB氨基酸。小鼠CNDP2的基因敲除丢失了组织氨基酸BHB酸化活性，降低了BHB氨基酸水平。最丰富的BHB氨基酸BHB-Phe是Lac-Phe的酮症诱导同源物，可激活下丘脑和脑干神经元并抑制进食。相反，在补充外源性酮酯或生酮饮食后，CNDP2-KO小鼠的食物摄入量和体重增加。CNDP2依赖性氨基酸BHB酸化和BHB氨基酸代谢产物在人类中也是保守的。因此，酶促氨基酸BHB酰化定义了一个酮旁路途径和与能量平衡相关的生物活性酮代谢物。
亮点：
1.酮旁路通过与氨基酸结合衍生β-羟基丁酸。
2.BHB氨基酸是内源性小鼠和人类代谢物。
3.BHB-Phe给药可减少肥胖小鼠的食物摄入量和体重。
论文ID
原名：A β-hydroxybutyrate shunt pathway generates anti-obesity ketone metabolites
译名：β-羟基丁酸旁路通路产生抗肥胖酮体代谢物
期刊：Cell
IF：45.5
发表时间：2024.11
通讯作者：Jonathan Z. Long，徐勇
通讯作者单位：斯坦福大学，美国贝勒医学院
实验设计
实验结果
1. CNDP2在体外催化氨基酸的BHB酰化
为了确定CNDP2是否可以在体外催化氨基酸的BHB酸化（图1A），我们将BHB和苯丙氨酸（各20mM）与HEK293T细胞的细胞裂解物一起孵育，这些细胞用FLAG标记的小鼠CNDP2或GFP对照瞬时转染。蛋白质印迹证实了CNDP2蛋白的过表达（图S1A）。在37°C下孵育1小时后，我们使用液相色谱-质谱（LC-MS）测量预期的缩合产物BHB-Phe。如图1B所示，与GFP转染的细胞裂解物相比，CNDP2转染的细胞溶解物表现出>140倍的苯丙氨酸-BHB酸化活性。因此，CNDP2除了之前报道的Lac-Phe合成活性外，还可以合成BHB-Phe。我们进行了几个对照实验，以检查CNDP2依赖性BHB酰化反应的底物特异性。CNDP2表现出类似的氨基酸BHB酸化和N-内酯化速率，但不能接受更短（如乙酸盐、C2）或更长（如辛酸盐、C8）的有机酸作为底物（图1C）。在氨基酸方面，CNDP2使用苯丙氨酸作为底物表现出最快的BHB酰化活性（图1D）。其他一些疏水性氨基酸也可反应，但与苯丙氨酸相比活性较低（<20%），许多测试的氨基酸没有观察到活性（图1D）。CNDP2无法进行肽底物游离N末端的BHB酰化（图S1B）。CNDP2也无法接受BHB异构体3-羟基异丁酸（3-HIB）作为底物，但我们确实观察到CNDP2与2-羟基丁酸（2-HB）有轻微的缩合活性（图S1C）。
图1 CNDP2在体外催化氨基酸BHB酰化。（A）CNDP2依赖性Lac-Phe合成和推测的CNDP2相关BHB-Phe合成反应示意图。（B）转染GFP或小鼠CNDP2-FLAG的细胞裂解物的BHB-Phe合成活性。（C和D）用GFP或小鼠CNDP2-FLAG转染的细胞裂解物的合成活性，并与具有Phe的指定单羧酸或具有BHB的指定氨基酸一起孵育（C）。（E和F）以BHB（E）或乳酸（F）为有机酸供体的重组纯化小鼠CNDP2-FLAG蛋白的Michaelis-Menten动力学。（G）BHB-Phe与小鼠CNDP2活性位点的分子对接。（H和I）用指定的小鼠WT或突变CNDP2质粒转染的HEK293T细胞的BHB-Phe合成活性（H）或Lac-Phe合成活性（I）。对于酶测定，有机酸和氨基酸在37°C下以20 mM的浓度孵育1小时。对于（B）-（F）、（h）和（I），n=3-4/组。（B）-（F）、（H）和（I）的数据显示为平均值±SEM。p值通过Student双侧t检验计算。
为了定量比较CNDP2依赖性BHB酸化和N-内酯化的动力学，我们制备了纯化的重组小鼠CNDP2-FLAG蛋白，用于体外动力学测定。所得动力学数据符合Michaelis-Menten动力学，表明相较于乳酸，BHB实际上是CNDP2亲和力更高的底物（BHB的Km=8.8 mM；乳酸盐的Km=33.4 mM，图1E和1F）。相比之下，在底物浓度饱和的条件下，CNDP2依赖的Lac-Phe合成比BHB-Phe合成更快（乳酸的Vmax=62.7 nM/min/mg，BHB的Vmax=3.5 nM/min/mg，图1E和1F）。
最后，我们将产物BHB-Phe对接到CNDP2活性位点（图1G）。该模型预测了BHB-Phe与关键活性位点残基（包括E166、D195和H455）的几种相互作用。我们通过瞬时转染HEK293T细胞产生了这些残基的单点突变（图S1D）。在每种情况下，这些活性位点残基的任何突变都会同时减少CNDP2依赖性BHB-Phe和Lac-Phe的产生（图1H和1I）。因此，BHB酰化和N-乳酰化活性都完全编码在CNDP2多肽中。此外，这两种催化活性不能通过活性位点口袋中的单点突变轻易分开。
2. 小鼠组织中CNDP2依赖性BHB酸化
为了确定内源性CNDP2是否催化小鼠组织中的氨基酸BHB酸化，我们首先使用抗CNDP2抗体通过蛋白质印迹检测CNDP2的组织表达。使用CNDP2-KO小鼠的组织证实了该抗体的特异性（图S2A）。CNDP2蛋白水平在肾脏和肠道中最高，在许多其他组织中较低（图2A）。接下来，我们使用野生型（WT）小鼠的肾、肠、脑、肝和股四头肌组织的粗总裂解物评估了体外BHB-Phe合成活性。我们选择这些组织是因为它们具有广泛的CNDP2蛋白表达。如图2B所示，在肾脏和肠道中观察到最高的BHB-Phe合成活性（∼10-30pmol/min/mg），而大脑、肝脏和股四头肌显示出较低但可检测的BHB-苯丙氨酸合成活性（约1-5 pmol/min/mg）。这种跨组织的BHB-Phe合成模式在很大程度上与这些组织中CNDP2的蛋白质表达吻合。此外，肾BHB-Phe合成活性的温度依赖性也与重组CNDP2蛋白相似（图S2B和S2C）。因此，CNDP2蛋白的组织表达模式和温度分布都与组织BHB-Phe合成活性相关。
图2 CNDP2是小鼠组织中主要的BHB氨基酸合成酶。（A）使用抗CNDP2（顶部）或抗微管蛋白（底部）抗体对指定小鼠组织进行蛋白质印迹。（B–F）当以BHB和Phe（B）、BHB和Leu（C）、BHB和Val（D）、乳酸盐和苯丙氨酸（E）或肌肽（F）为底物时，WT或CNDP2-KO小鼠组织的酶活性。对于酶测定，有机酸和氨基酸在37°C下以20 mM的浓度孵育1小时。对于（B）-（F），n=3-4/组。（B）-（F）的数据显示为平均值±SEM。p值通过Student双侧t检验计算。
我们使用CNDP2-KO小鼠的组织来确定CNDP2对组织BHB-Phe合成活性的影响。如图2B所示，在CNDP2-KO小鼠的组织中，肾脏和肠道BHB-Phe合成活性大大降低（>95%降低）。其他组织中较小的BHB-Phe合成活性也大大降低（脑中降低>85%，肝中降低>75%，股四头肌中降低>60%）。我们使用亮氨酸或缬氨酸作为体外BHB酰化的底物，观察到WT和CNDP2-KO组织中BHB-Leu和BHB-Val合成的相似模式（图2C和2D）：WT小鼠的肾脏和肠道组织都表现出最高的BHB氨基酸合成活性，而这种活性在CNDP2-K0小鼠的组织中基本上被消除。在另外的对照实验中，我们测定了组织Lac-Phe合成活性，该活性再次表现出与BHB氨基酸合成相似的模式和CNDP2依赖性（图2E）。相比之下，肌肽在组织间的水解表现出明显的模式，肝脏和股四头肌的活性最高，肾脏、肠道和大脑的活性很低（图2F）。CNDP2-KO组织中的肌肽酶活性没有改变（图2F）。我们得出结论，CNDP2是小鼠组织中负责BHB氨基酸合成活性的主要酶。此外，尽管CNDP2之前有体外活性注释，但它不是一种主要的组织肌肽酶。
3. BHB氨基酸是小鼠内源性代谢产物
CNDP2催化的BHB酰化反应的产物BHB氨基酸以前从未被报道为内源性代谢物。因此，我们开发了一种靶向代谢组学方法，以确定是否可以在小鼠血浆中检测到BHB氨基酸。我们首先通过BHB和苯丙氨酸之间的经典酰胺偶联合成了真正的BHB-Phe标准品（图3A；参见STAR方法）。真实BHB-Phe标准品的裂解揭示了对应于Phe（m/z=164）的主要子离子和对应于脱羧产物（m/z=206）的第二个较小的子离子。接下来，我们开发了一种基于高效液相色谱与三重四极杆质谱联用（QQQ-LC/MS）的靶向多反应监测（MRM）方法，用于监测BHB-Phe的母体向苯丙氨酸的转变。在小鼠血浆中，我们发现了一个内源性峰，该峰在与真实标准品相同保留时间内洗脱（图3A）。为了排除这种方法也可能检测到isobaric 2-HB-和3-HIB-苯丙氨酸异构体的可能性，我们合成了2-HB-Phe和3-HB-Phe的真实标准品，并开发了可以区分这三种分子的MRM方法。尽管2-HB-Phe和3-HIB-Phe也产生了与苯丙氨酸相对应的子离子，但我们还确定了每种异构体的独特转变（2-HB-Phe:260>102，在N-Cα处断裂；3-HIB-PH:250>220，CH3O损失，图S3A和S3B）。对于BHB-Phe，250>164的转换检测到总信号的99%以上，使用260>102和250>164（比例为6:1）检测到2-HB-Phe，使用250>220和250>64（比例为1.6:1）检测到3-HIB-Phe（图S3C）。我们发现内源性峰值的信号占260>164跃迁的99%以上（图S3C）。因此，内源性信号是BHB-Phe；此外，2-HB-Phe和3-HIB-Phe不是内源性代谢物。
图3 小鼠血浆中BHB氨基酸的检测及其酮症诱导性。（A-D）使用BHB-Phe（A）、BHB-Val（B）、BHB-Leu（C）和BHB-Met（D）的指示多反应监测转换，对真实标准品（左）进行二级质谱裂解，并将标准品和小鼠血浆中的内源性峰（右）共洗脱。（E–H）基线时、生酮饮食1周后（研究饮食D21021803）、口服酮单酯饮料24小时或30分钟后（3 g KE/kg体重），8至9周龄雄性C57BL/6J小鼠血浆中BHB氨基酸的定量。对于（E）-（H），n=5/组，基线n=15（三组各取一）。（E）-（H）的数据如方框图和须状图所示。p值通过Student双侧t检验计算。
接下来，我们合成了BHB-Leu、BHB-Val和BHB-Met的真实标准品，这些标准品也表现出相同的特征氨基酸子离子（图3B-3D）。使用类似的MRM方法，我们还检测到内源性峰，其过渡和保留时间与真实标准相同（图3B-3D），表明这些其他BHB氨基酸也是内源性代谢物。
由于其生物合成来源于BHB，预计循环中的BHB氨基酸会随着BHB水平的增加而增加，例如营养或生理酮症所达到的水平。因此，在生酮饮食1周、禁食24小时或口服酮酯饮料（3 g/kg体重）后，我们测量小鼠血浆中BHB氨基酸的水平。我们证实，每种情况都会使血浆BHB水平升高（图S3D）。所有这些刺激持续地使每种BHB氨基酸都显著升高2至10倍（图3E-3H）。生酮饮食在诱导BHB氨基酸水平方面产生了更大的变化，这可能反映了与其他两种急性酮症刺激物（≤24小时）相比，这种扰动（1周）具有更慢性的性质。苯丙氨酸、Lac-Phe和乳酸的水平在三种酮症刺激下没有一致的变化（图S3D）。酮酯经口灌胃后，BHB-Phe的组织水平也可检测到并升高（图S3E）。我们得出结论，BHB氨基酸是内源性、酮症诱导的小鼠代谢产物
4. CNDP2和HMGCL对BHB氨基酸的遗传调控
图4A显示了已知酮生成和酮分解途径中CNDP2依赖性酮代谢分流途径的示意图。为了直接测试CNDP2对BHB氨基酸生物合成的生理贡献，我们在酮酯饮料或生酮饮食1周后测量了CNDP2-KO小鼠血浆中的BHB氨基酸。在急性服用酮酯饮料后，CNDP2-KO小鼠表现出多种血浆BHB氨基酸消耗超过90%（图4B）。CNDP2-KO小鼠在生酮饮食1周后也观察到多种BHB氨基酸的减少（图4C）。在这两个实验中，WT和CNDP2-KO小鼠的血浆BHB、乳酸或苯丙氨酸水平没有一致的变化，正如预期的那样，CNDP2-KO小鼠的Lac-Phe水平降低了（图S4A和S4B）。
图4 CNDP2和HMGCL对BHB氨基酸的遗传调控。（A）酮生化途径示意图和使用的遗传小鼠模型。（B-D）口服酮单酯饮料（3 g KE/kg体重）后60分钟，4至10周龄雄性WT和CNDP2-KO小鼠血浆中BHB氨基酸的定量（B），生酮饮食1周后7至16周龄雌性WT和CNPD2-KO小鼠（研究饮食D06040601，C），或24小时禁食后Hmgclfl/fl与Alb Hmgcl-/-小鼠（D）。对于（B），WT的n=7，KO的n=4。对于（C），每组n=8。对于（D），Hmgclfl/fl的n=5，Alb的n=4。（B）-（D）的数据如方框图和须状图所示。p值通过Student双侧t检验计算。
我们在CNDP2-KO小鼠中对有机酸-氨基酸偶联物进行了额外的代谢组学分析。野生型和CNDP2-KO小鼠之间的N-乙酰基-Phe、N-乙酰基-Val、N-乙酰基-Leu和N-乙酰基-Met及其相应的游离氨基酸没有变化（图S4C）。我们无法检测到N-丙基、N-丁酰基或N-辛酰基氨基酸（分别为C3、C4和C8，见图S4C），这可能反映了与乙酸盐、乳酸盐和BHB相比，相应有机酸的循环丰度较低。
接下来，我们研究了HMGCL肝特异性缺失的影响，HMGCL是肝酮生成中的关键上游酶（图4A）。我们从HMGCL（Alb-HMGCL-/-小鼠）的肝脏特异性KOs中获得了血浆，这些KOs之前是通过将Albumin-cre小鼠与HMGCLfl/fl小鼠杂交产生的。这些动物血浆中的几种BHB氨基酸，如BHB-Met、BHB-Leu和BHB-Val，而非BHB-Phe，减少了约50%-80%（图4D）。我们证实Alb-Hmgcl-/-小鼠血浆中BHB水平降低了30%，此外，与Hmgclfl/fl对照组相比，乳酸、Lac-Phe或苯丙氨酸水平没有变化（图S4D）。这些数据共同确定了调节循环BHB氨基酸水平的两种上游酶HMGCL和CNDP2的遗传和生化需求。
5. BHB-Phe在摄食行为和体重调节中的作用
BHB-Phe是最丰富的BHB氨基酸（图3E）。这种代谢物是Lac-Phe的同源物，具有化学相似性以及通过CNDP2的共同生物合成途径。因此，我们考虑了BHB-Phe也可能在功能上与Lac-Phe相似，并调节食物摄入量和体重的可能性。我们首先使用功能增益方法来确定BHB-Phe是否足以减少食物摄入和体重。在代谢室中对饮食诱导肥胖（DIO）小鼠的初步研究中，BHB-Phe（50mg/kg，腹腔注射[i.p.]）减少了食物摄入，而不影响运动、耗氧量或二氧化碳产生（图5A-5E）。呼吸交换率（RER）降低，这与食物摄入的抑制一致（图5E）。在这些条件下，血浆BHB-Phe水平在1小时的时间点达到约20μM的峰值，并在3小时后恢复到基线值（图S5A）。在家笼中的一项独立实验中，我们发现对DIO小鼠急性给药BHB-Phe（50mg/kg，i.p.）抑制了食物摄入，而不影响水的摄入，建立了食物与液体摄入的特异性抑制（图S5B）。最后，在单次给药BHB-Phe（50mg/kg，i.p.，图S5C）后，小鼠的其他喂养调节激素（如胃饥饿素、瘦素和GDF15）的血浆水平也没有变化。
图5 BHB-Phe抑制食物摄入和体重。（A-E）在代谢笼中单次注射对照或BHB-Phe（50mg/kg，i.p.）10小时后，单饲养的29周龄雄性DIO小鼠的食物摄入量（A）、运动量（B）、耗氧量（VO2）（C）、二氧化碳产生量（VCO2）（D）和呼吸交换率（RER）（E）。（F和G）用空白或BHB-Phe（50mg/kg/天，i.p.）治疗的28周龄雄性DIO小鼠的体重（F）和累积食物摄入量（G）的变化。起始体重为对照：46.4±1.4 g，BHB-Phe 45.7±1.0 g（平均值±SEM）。（H）用对照、BHB-Phe（50mg/kg/天，i.p.）或对照处理的配对喂养小鼠处理6天后，15周龄雄性DIO小鼠的体重（左）和每日食物摄入量（右）的变化。起始体重为对照：39.4±2.3 g，BHB-Phe:38.5±0.8 g，配对喂养：37.8±0.6 g（平均值±SEM）。（I）用对照剂、BHB-Phe、BHB或苯丙氨酸（50mg/kg/天，I.p.）处理9天后，13周龄雄性DIO小鼠的体重（左）和食物摄入量（右）的变化。起始体重为对照：36.2±0.7g，BHB-Phe:37.9±2.1g，BHB:36.8±1.1g，Phe:34.5±0.5g（平均值±SEM）。（J和K）用Phe-Phe、BHB-Lys、Leu-Leu、BHB-Phe（50mg/kg/天i.p.）或对照处理9天后，14至16周龄雄性DIO小鼠的体重（J）和食物摄入量（K）的变化。起始体重为对照：41.2±1.3 g，BHB-Phe:39.1±1.7 g，BHB-赖氨酸：40.1±2.2 g，Phe-Phe:40.8±1.4 g，Leu-Leu:41.2±1.3 g（平均值±SEM）。（L和M）单笼19至32周龄雄性WT和CNDP2-KO小鼠的体重（L）和食物摄入量（M）的变化，这些小鼠因高脂肪饮食喂养11至19周而变得肥胖，并接受酮酯（3 g/kg/天，口服）。起始体重为WT:46.8±1.4 g，CNDP2-KO:47.1±1.3 g，p>0.05（平均值±SEM）。对于（A）-（E），对照n=7，BHB-Phe n=8。对于（F）和（G），每组n=10。对于（H）-（K），每组n=5。对于（L）和（M），每组n=9。（A）-（G）、（J）、（L）和（M）中的数据显示为平均值±SEM。（H）、（I）和（K）中的数字显示为方框图和须状图。p值通过Student双侧t检验或双因素方差分析计算。
我们在DIO小鼠中进行了BHB-Phe的慢性研究。每日服用BHB-Phe（50mg/kg/天，i.p.）可持久抑制每日食物摄入量，并如预期的那样，同时减少体重增加（图5F和5G）。在实验结束时，BHB-Phe处理的小鼠表现出天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和总甘油三酯（TG）的降低；高密度脂蛋白（HDL）或低密度脂蛋白胆固醇（LDL）没有变化（图S5D）。BHB-Phe治疗小鼠体重减轻量与配对喂养的对照组相同（图5H），表明观察到的食物摄入抑制解释了BHB-Phe-治疗小鼠体重的观察变化。
了解BHB-Phe的结构要求对其减肥效果很重要，我们测试了其他结构相关代谢物的效果。首先，尽管BHB-Phe（50mg/kg/天，i.p.）的效率抑制了DIO小鼠的体重和食物摄入量，但单独使用BHB或相同剂量的单独使用苯丙氨酸都没有效果（图5I）。其次，相关代谢产物BHB-Lys（50mg/kg，i.p.），以及二肽Phe-Phe（50mg/kg）和Leu-Leu（50mg/kg、i.p.）也未能减少食物摄入量或体重（图5J和5K）。第三，我们测试了其他CNDP2调控的BHB偶联物，包括BHB-Met、BHB-Leu和BHB-Val。这些代谢物由BHB与疏水性氨基酸偶联而成；其中两个，BHB-Leu和BHB-Val，代表与支链氨基酸结合的BHB（BHB-BCAA）。在这种情况下，我们观察到每种BHB-Met、BHB-Leu和BHB-Val的体重降低活性（图S5E）。因此，BHB-Phe和其他CNDP2调节的BHB疏水性氨基酸偶联物，包括BHB-BCAA，在小鼠中具有厌食和抗肥胖作用，而BHB与其他必需氨基酸（如BHB-Lys）以及其他二肽的偶联物则没有表现出相同的生物活性。
最后，我们使用CNDP2-KO小鼠来检查BHB氨基酸对能量平衡的生理贡献。我们之前报道了Cndp2基因和糖酵解刺激的基因-环境相互作用：Cndp2-KO小鼠在标准高脂肪饮食喂养方案后体重正常；然而，当糖酵解刺激增加Lac-Phe水平（通过踏车运动或二甲双胍治疗）时，与WT型对照组相比，KO动物表现出食物摄入量和体重表型的增加。为了确定BHB氨基酸的贡献，在初步实验中，我们给因高脂肪饮食喂养而肥胖的WT和CNDP2-KO小鼠服用酮酯（3 g/kg/天，口服）11-19周。在实验开始时，基因型之间的体重没有差异。在12天的酮酯治疗结束时，WT小鼠平均减少了-0.3±0.4克，而CNDP2-KO小鼠增加了+1.0±0.2克（平均值±SEM，p<0.05，图5L）。CNDP2-KO小鼠的累积食物摄入量也高于WT小鼠（图5M）。在第二个实验中，我们将WT和CNDP2-KO小鼠置于生酮饮食中。基因型之间的初始体重再次没有差异。到实验结束时，生酮饮食的CNDP2-KO小鼠比WT小鼠体重增加更多，吃的食物也更多（图S5F）。我们证实，Lac-Phe和BHB-Phe分别在短跑跑步机运动和酮酯或生酮饮食处理后独立诱导（图S5G）。因此，酮酯和生酮饮食代表了环境扰动，揭示了Cndp2基因型对体重和食物摄入的影响。
6. BHB-Phe激活下丘脑和脑干的神经群
为了更好地理解BHB-Phe抑制进食的神经生物学机制，我们首先使用药理学和遗传学方法来确定BHB-Phe的作用是否可能由下丘脑黑皮质素信号传导、胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）或脑干GDNF家族受体α样（GFRAL）途径介导。BHB-Phe（50mg/kg，i.p.）对WT或黑皮质素4受体（MC4R）-KO小鼠的食物摄入量和体重的影响相似（图S6A和S6B）。同样，GLP-1R拮抗剂Exendin-3（0.1mg/kg/天，腹腔注射）有效地阻断了GLP-1（2mg/kg/天，静脉注射，图S6C和S6D）的厌食和抗肥胖作用；然而，在这些相同的Exendin-3下，BHB-Phe对食物摄入量和体重的影响没有改变（图S6E和S6F）。我们获得了一种中和性抗GFRAL抗体，并验证了该抗体（10mg/kg，皮下[SQ]）完全阻断了重组GDF15的活性，以抑制食物摄入和体重（4nmol/kg，SQ）（图S6G）；然而，BHB-Phe对喂养和体重的影响不受抗GFRAL抗体给药的影响（图S6H和S6I）。我们得出结论，BHB-Phe的厌食活性与这些已知的摄食控制途径无关。
接下来，我们使用活性依赖性基因标记策略（TRAP，活性群体中的靶向重组）来鉴定BHB-Phe药理学给药后激活的神经元。在这种方法中，在BHB-Phe处理后，报告cassette（tdTomato）的c-Fos依赖性重组能够永久性地对BHB-Phe进行遗传标记。我们用BHB-Phe（50mg/kg，i.p.）处理TRAP2小鼠（TRAP2/Rosa26-LSL tdTomato），30分钟后用4-羟基他莫昔芬处理，以在BHB-Phe-激活的神经元中启动cre依赖性重组。2周后，相同的小鼠接受Lac-Phe（50mg/kg，i.p.）处理，90分钟后处死进行c-Fos免疫染色（图6A）。因此，这种实验方法能够同时识别同一动物中BHB-Phe激活的（例如，以tdTomato标记的TRAP+）和Lac-Phe激活的（如c-Fos+）神经元。我们检查了多个下丘脑和脑干区域的TRAP+或c-Fos+神经元。与对照处理相比，BHB-Phe和Lac-Phe都激活了多个脑区的神经元群，包括脑室旁下丘脑核（PVH）、视交叉上核（SCN）、下丘脑背内侧核（DMH）、下丘脑腹内侧核（VMH）、下丘脑性弓状核（ARH）、外侧下丘脑（LH）、外侧臂旁核（LPBN）和孤束核（NTS）（图6B）。对每个区域的TRAP+神经元和c-Fos+神经元的详细分析表明，只有一小部分（约2%-30%）的神经元被BHB-Phe和Lac-Phe激活（例如，双TRAP+/c-Fos+），而绝大多数激活的神经元是不同的（图6C）。图6D显示了所示区域的代表性截面。由于TRAP重组和c-Fos免疫反应性可能对标记激活的神经元具有不同的敏感性，我们在TRAP2/Rosa26-LSL tdTomato小鼠的独立队列中重复了这一实验，但现在逆转了BHB-Phe/Lac-Phe顺序。在这个反向实验中，我们通过TRAP重组鉴定了Lac-Phe激活的神经元，而通过c-Fos免疫反应鉴定了BHB-Phe激活的神经元（图S7A）。再次，尽管Lac-Phe和BHB-Phe都激活了下丘脑和脑干中的神经群（图S7B），但对每个区域的详细分析表明，这两种激活的神经元群在很大程度上是不同的（图S7C）。我们得出结论，BHB-Phe的药理学给药以与Lac-Phe重叠但不同的方式激活了与进食行为有关的几个下丘脑和脑干区域。
图6 脑内BHB-Phe和Lac-Phe激活神经元的TRAP/c-Fos图谱。（A）绘制BHB-Phe和Lac-Phe激活神经元的实验设计示意图。TRAP，活性群体中的靶向重组。（B）热图显示了不同脑区中VehTRAP-、BHB-PheTRAP-、Vehc-Fos-和Lac-Phec-Fos标记神经元的数量。ARH，下丘脑弓状核；DMH，下丘脑背内侧；LH，下丘脑外侧；LPBN，外侧臂旁核；NTS，孤束核；PVH，室旁下丘脑；SCN，视交叉上核；VMH，腹内侧下丘脑。（C和D）指定脑区TRAP+/C-Fos+神经元的定量（C）和代表性切片（D）。对于（B）和（C），每组n=3。（C）中的数据显示为平均值±SEM。比例尺为100μm。
7. 人体CNDP2酶活性和BHB氨基酸的保护
最后，我们试图了解CNDP2依赖性氨基酸BHB酸化途径对人类的保护作用。首先，我们使用BHB和苯丙氨酸作为底物，获得了人重组CNDP2，其表现出预期的体外BHB酰化活性（图7A）。使用增加浓度的BHB的Michaelis-Menten动力学也显示出与小鼠CNDP2酶相似的底物亲和力和最大速度（图7B）。接下来，我们鉴定了三种表达hCNDP2的人类细胞系：U937巨噬细胞、Caco-2肠上皮细胞和PANC-1胰腺导管细胞。对于每种人类细胞系，我们通过CRISPR-Cas9产生了对照和hCNDP2 KO系。我们使用抗CNDP2抗体通过蛋白质印迹验证了hCNDP2的完全丧失（图7C-7E）。敲除每个细胞系中的hCNDP2导致细胞裂解物BHB氨基酸合成活性几乎完全丧失。这些数据表明，人类细胞中存在内源性氨基酸BHB酸化活性，主要由CNDP2介导（图7C-7E）。最后，为了确定BHB氨基酸是否是内源性人类代谢物，我们在一项外源性酮补充试验中测量了一部分参与者的BHB氨基酸血浆水平。禁食过夜（>8小时）后，参与者饮用酮单酯饮料（0.3 g/kg HVMN酮酯），1小时后收集血浆。在基线血浆样本中也可检测到BHB-Phe、BHB-Leu、BHB-Val和BHB-Met，在服用酮酯饮料后升高（图7F）。正如预期，酮酯饮料增加了BHB的水平，而苯丙氨酸、Lac-Phe和乳酸的水平保持不变（图7G）。因此，CNDP2介导的氨基酸BHB酸化和BHB氨基酸代谢产物在人类中都是保守的。
图7 人血浆中CNDP2活性和BHB氨基酸。（A和B）具有指定底物的重组人CNDP2的BHB-Phe合成酶活性（A）和重组人CNPP2蛋白随着BHB底物浓度增加的Michaelis-Menten动力学（B）。（C–E）顶部：来自WT或CNDP2-KO人细胞系U937（C）、Caco-2（D）或PANC-1（E）的细胞裂解物的BHB-Phe合成活性。底部：使用抗CNDP2（上）或抗微管蛋白（下）抗体对WT和CNDP2-KO U937（C）、Caco-2（D）和PANC-1（E）细胞进行蛋白质印迹。（F和G）在基线或酮酯饮料处理后60分钟（0.3 G/kg酮酯），人血浆中BHB氨基酸（F）或指定代谢物（G）的水平。对于（A）和（C）-（E），在37°C下用20 mM底物进行反应1小时。对于（A）-（E），n=3-5/组。对于（F）和（G），n=7/组。对于（A）-（E），数据显示为平均值±SEM。对于（F）和（G），数据显示为方框和须形罐。p值通过Student双侧t检验计算。
在这里，我们表明CNDP2控制着BHB代谢的次级途径，导致BHB衍生代谢产物家族BHB氨基酸的产生。此外，BHB-Phe是最丰富的BHB氨基酸，是Lac-Phe的结构和功能同源物，可以减少食物摄入和体重。这些数据表明，BHB的生化途径不仅限于初级代谢中间体，还包括调节能量稳态的BHB衍生信号代谢物。
CNDP2可以接受BHB或乳酸作为底物，这代表了一种不寻常的生化机制，它直接将代谢状态与生物活性代谢物的产生结合起来。据我们所知，这种多功能、通量依赖的酶偶联机制以前从未被描述过。对这些数据的一种解释是，CNDP2是糖酵解或酮症通量的“传感器”，取决于乳酸或BHB水平是否升高。效应分子只是底物的代谢衍生物，因此，它代表了信号可以转化为效应分子的最简单模型之一。
CNDP2依赖的BHB氨基酸生物合成的化学逻辑反映了其他信号分子的化学逻辑：在每种情况下，较低丰度的生物活性物种都是由较高丰度的前体产生的。例如，类固醇激素由胆固醇产生，甲状腺激素由酪氨酸产生，前列腺素由脂肪酸产生，组胺由组氨酸产生。我们的数据显示，丰富的前体不仅限于氨基酸、胆固醇或脂质，还可以包括其他丰富的代谢原料，如BHB。此外，这种CNDP2依赖性机制在CNDP2+细胞（如巨噬细胞、其他免疫细胞以及肾脏和肠道的上皮细胞）中起作用，这些细胞类型通常与BHB代谢无关。
尽管过去的研究报告了与小鼠和人类体内酮水平升高相关的厌食和抗肥胖作用，但这绝不是一个综合现象。我们的数据表明，BHB的作用也延伸到BHB衍生的代谢物。因此，BHB氨基酸水平的潜在变化可能是导致先前研究中报告的酮症和能量平衡相互冲突的重要因素。事实上，我们自己的数据表明，循环BHB氨基酸水平的变化与BHB自身循环水平的变化相关，但不是线性决定的；因此，在未来的酮症和肥胖研究中，应考虑控制BHB氨基酸水平的变化（以及潜在的CNDP2基因型）。从目的论角度来看，高酮水平是肝脏酮生成增加和脂肪脂肪分解提供脂肪酸底物的产物。因此，高酮状态表明有足够的脂肪脂质储存可用于酮生成。因此，对高酮和食物摄入抑制之间关联的一种潜在解释可能是酮和BHB氨基酸预示着脂肪充足的状态。此外，我们的数据表明下丘脑和脑干神经群是BHB-Phe的潜在下游靶点。
我们的研究也扩展了我们对能量平衡中基因与环境相互作用的理解。此前，我们已经证明，CNDP2-KO小鼠仅在跑步或二甲双胍治疗后表现出体重表型，而在“标准”高脂肪饮食喂养条件下则没有。因此，只有在提供适当和特定的环境刺激时，才能揭示与Cndp2基因相关的表型。我们的研究确定酮酯给药和生酮饮食是CNDP2依赖性表型的环境因素，并表明增加生酮的额外营养或生理干扰可能是与CNDP2基因相互作用的相关环境刺激。
BHB氨基酸在我们的质谱分析中可被可靠地检测到，但在之前的代谢组学研究中没有被注释，这有两个原因。首先，我们对CNDP2的酶学研究，以及乳酸和BHB之间密切的化学相似性，为BHB氨基酸的生物合成起源提供了一个令人信服且可直接测试的生化假说。其次，我们对BHB氨基酸标准品的化学合成，使我们能够确认内源性峰的保留时间和裂解，否则这些标准品在市场上是不可用的。我们检测BHB氨基酸的策略表明，通过将真实的代谢物标准与底物化学相似性和生化反应混杂性的假设相结合，代谢组学空间可能会得到更广泛的注释。
结论
尽管我们在这里的研究只考察了BHB氨基酸在能量稳态中的作用，但BHB氨基酸的生理功能也可能扩展到其他生理环境。例如，酮症正在各种其他情况下进行探索，如神经退行性疾病、炎症、肌肉弹性、癌症治疗和其他几种年龄相关疾病。此外，在其他病理生理条件下，如糖尿病酮症酸中毒，也可观察到BHB升高。我们的数据表明，当BHB水平高时，也会产生BHB氨基酸，这增加了酮症和BHB在其他情况下的影响也可能至少部分是由BHB氨基酸的同时产生介导的。
研究的局限性
本研究有四个主要局限性。首先，我们发现BHB-Phe激活了下丘脑和脑干中的神经群。然而，我们并没有进一步探究这些神经元的分子“身份”，也没有探究其激活的功能后果。未来的实验将确定哪些与摄食相关的大脑区域和细胞类型是BHB-Phe厌食作用的重要下游效应物。其次，我们通过药理学施用 BHB-氨基酸进行的功能获得充分的研究，在循环中实现了代谢物的超生理水平。虽然我们没有测试更低水平、更生理相关的浓度，但可能会揭示更多关于这些酮代谢物如何在生理背景下影响摄食和神经回路的微妙关系。更低水平、更生理相关的浓度可能会选择性地激活不同的神经元亚群，或对摄食行为或体重产生更细微的影响。本实验可能阐明潜在存在的剂量依赖性，其中 BHB-氨基酸的组合在较低剂量下协同作用以调节神经或代谢反应。第三，我们尚未确定只能接受BHB或乳酸作为底物的CNDP2点突变体，此类突变体将能够在体外和体内对CNDP2活性的这些多个生化分支进行功能切分。第四，我们的研究使用的是整只CNDP2-KO 小鼠，无法对体内总 BHB-氨基酸合成有贡献的细胞类型问题进行特定分配。使用条件性 CNDP2-KO 小鼠可能会更关注于某些器官，例如对全身 BHB 氨基酸合成的贡献更大的肠道。
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39536746/
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