自从上世纪九十年代首款寡核苷酸类药物上市以来，已经陆续有十几款核酸类药物获批，且在研核酸药物数量呈爆发式增长。寡核苷酸类药物的范围比较广，包括反义核酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)等。对于这类药物，除日本PMDA在2020年发布过一篇寡核苷酸类药物临床前安全性评价的指南，FDA则在2021年发过一篇“Nonclinical Testing of individualized antisense oligonucleotide drug products for severely delibitating or life-threatening diseases”，2024年11月，美国FDA发布《Nonclinical Safety Assessment of Oligonucleotide-Based Therapeutics; Draft Guidance for Industry》，尚无其它特定的非临床研究指导原则出台。虽然ICHS6中也有提到“the principles provided by the guidelines can also be applied to oligonucleotides”，但毕竟核酸类药物是在细胞内发挥作用，还涉及化学修饰，与传统生物技术药物有很大不同，单纯参考ICH S6是不够的。好在已上市和在研核酸类药物非常多，已经积累了足够经验，本文结合国内外公开发表的文献，并主要参考日本PMDA指南，略作讨论。
先看下寡核苷酸类药物与生物药、化药的异同点。
寡核苷酸类药物非临床安全性评价的目的与传统化药或者生物药是一致的，评估药物潜在的靶器官、剂量或暴露量依赖性、毒性的可逆性等。另外，很多指导原则比如ICH M3、ICH S6也是可以根据具体情况参考的。如果药物治疗威胁生命或比较严重且无治愈手段的适应症，比如晚期肿瘤，也可以参考ICH S9。寡核苷酸类药物非临床安评策略更接近小分子化药，同时也要兼顾下生物药。
大部分寡核苷酸类药物（ASO、siRNA、miRNA）通过与目标序列杂交发挥作用，有点类似单抗与受体的结合，称之为“on-target”（在靶毒性）作用，产生的不良反应主要来自药理学作用的放大。如果与相似的非靶序列杂交，则会引起杂交依赖的脱靶毒性。因此，FDA建议在IND资料中需要体现采用BLAST或其他in silico或体外方法评估的杂交依赖的脱靶结合。既然有杂交依赖型，就有对应的非杂交依赖型，即由小核酸的结合、物理（如化学修饰）和化学性质引发的脱靶毒性。比如，PS骨架的ASO药物会出现凝血时间延长、补体激活，而补体激活又会导致血压降低。又如siRNA会刺激免疫激活。药理学作用的放大和两类脱靶毒性共同形成了寡核苷酸类药物的毒性来源，如下图所示。
动物种属
与传统化药、生物药要求类似，寡核苷酸类药物也需要啮齿+非啮齿类两种动物用于毒理学研究。其中，在靶毒性既然与药理学作用放大相关，自然要求寡核苷酸类药物在对应种属中有药理学活性。由于非人灵长类mRNA与人的同源性比较高，通常为非啮齿类常用动物。不过，单个碱基的错配也会很大程度上影响核酸类药物的活性，因此除了序列对比，最好还有些体外或者体内实验数据支持在对应种属中可产生药理学活性，比如毒理研究中伴随PD指标的考察。
如果啮齿类动物中没有药理学活性，则需要考虑采用替代分子或转基因模型策略。核酸类药物替代分子制备要比生物药物更容易且成本更低，可以通过体外受体结合或功能试验与临床候选分子做下对比。还有一点与生物药有些区别，对于生物药，根据ICHS6要求，如果短期重复给药毒理试验中，两个种属毒理表现类似，更长周期毒理研究中可以选择其中一种种属开展。这点对于寡核苷酸类药物不适用，更长周期通常还是选用两个种属。
重复给药毒性试验设计
剂量选择：PMDA认为最高剂量选择从两个维度考量，在靶毒性角度要求达到最大药理学作用。脱靶毒性则要求：1）最大耐受剂量（MTD）；2）暴露量饱和剂量；3）最大可行剂量（MFD）；4）临床拟用暴露量的50倍；5）1000mg/kg剂量，与ICH M3(R2)要求类似。通常设计3个剂量组以考察剂量-效应关系。
检测指标：除常规毒理指标外，建议增加PD指标考察，以确定供试品在该动物种属中产生了预期的药理学作用。还有一点，寡核苷酸类药物在体内并不是“雨露均沾”“均匀分布”，大都以肝、肾蓄积的表现为主，所以需重点关注下这两个器官的毒性。另外，不同类别的寡核苷酸类药物，有一些共同的毒性表现，可以参考同类药物的毒理学研究背景数据。下表简单罗列了常见寡核苷酸类药物分类、结构、靶标、结合特点和作用机制。
给药途径和给药频率：给药途径采用临床拟用途径。给药频率则要考虑临床PK特点。
研究周期：与ICH M3(R2)要求一致，通常最长给药期限为啮齿类给药26 周、非啮齿类给药39 周，可用于支持所有临床试验和上市。同时也要考虑到寡核苷酸类药物的一些特点，比如ASO类药物血浆半衰期很短（<1h），但是在肝、肾组织中的半衰期却可以长达14-30天。所以，很多ASO、siRNA每周或每月给药一次的频率即可维持药效。因此，在给药频率、恢复期设置方面要将这些特殊性考虑在内。
可逆性：参考ICH M3(R2)和ICH M3_R2_Q&As。
开展节点：参考ICH M3(R2)。
代谢和降解产物：通常天然核酸分子被核酸酶降解，不存在安全性方面的担忧。但是含化学修饰的代谢产物和降解产物则要按照ICH M3(R2)要求，开展非临床安全性评价，与传统化药要求一致。
杂质
寡核苷酸类药物的杂质主要分为寡核苷酸有关物质、有机小分子杂质、残留溶剂和元素类杂质。
有关物质由于可能与寡核苷酸药物具备相似的理化特性，需根据原料药或制剂安评结果，考虑有关物质在其中发挥的作用。当然，如果有关物质水平非常低，则无需考虑。
小分子杂质可以参考ICH Q3A和Q3B。残留溶剂可以参考ICH Q3C。元素类杂质则参考ICH Q3D(R1)。
药物递送系统/制剂
如果药物涉及偶联和脂质体，则需要采用制剂开展安全性评价，并需要考虑载体材料如蛋白、脂质、糖等对安全性的影响。
毒代动力学和药代动力学
需要根据ICH S3A要求检测系统暴露量。
安全药理研究
对于系统给药的核酸类药物，参照ICH S7A考察对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统的影响，但通常不需要单独开展。对于通过肝脏代谢、肾脏排泄的小核酸药物，安全药理试验中建议补充肝脏和肾脏安全药理试验。如果药物直接被递送至中枢神经系统，如鞘内给药，则仅开展以中枢神经系统为终点的安全药理研究即可。如果药物既不是系统给药，也不是颅内给药，仅局部给药局部发挥作用，如玻璃体内注射给药，FDA认为可不开展安全药理学研究。
考虑到寡核苷酸类药物不太可能对离子通道造成影响，FDA和PMDA相关指南均认为理论上不需要开展hERG试验。不过，很多已上市寡核苷酸类药物还是开展了hERG这项研究。
单次给药毒性试验
ICH M3(R2)和ICH S6(R1)对单次给药毒性试验的要求同样适用于寡核苷酸类药物，不建议单独开展此项研究，可以从剂量探索试验、药理学试验或重复给药毒理研究中获得数据。
遗传毒性研究
大部分寡核苷酸类药物是基于Watson–Crick碱基互补配对原则与mRNA相互作用。其它类型寡核苷酸如核酸适配体，也不会与核酸发生直接作用。因此，与基因治疗不同，寡核苷酸类药物不会整合进基因组，也不会对DNA造成影响。比如EMA就出过一个文件，“CHMP SWP Reflection Paper on the Assessment of the Genotoxic Potential of Antisense Oligodeoxynucleotides”，其中指出phosphorothioate nucleotides (as potential degradation products/metabolites from the PS oligodeoxynucleotides) are unlikely to pose a genotoxic hazard via incorporation into newly synthesized DNA. 所以诸如PS修饰的ASO类药物理论上不用开展遗传毒性研究。但FDA并未见类似意见出台。PMDA则认为天然核酸类药物不需要开展遗传毒性研究。不过，有化学修饰的核酸药物则需要参照ICH S2(R1)开展研究，常见组合是细菌回复突变实验+哺乳动物细胞染色体畸变实验或小鼠淋巴瘤Tk基因突变实验+体内微核实验或染色体畸变实验，与化药要求类似。也有文献提到，对于研究比较充分的化学修饰，可以考虑仅开展体内遗传毒性试验，而不是标准组合研究，不过这种策略事先最好还是先与监管机构沟通确认一下。目前，未发现寡核苷酸类药物有遗传毒性的先例。
生殖毒性研究
可参照ICH S5(R3)开展分段式生殖毒性试验。通常采用啮齿类动物开展生育力研究。啮齿类和兔开展胚胎-胎仔发育毒性试验。当啮齿类和兔不是相关种属时，可以考虑采用替代分子开展研究，不建议采用非人灵长类进行试验。证据权重分析对于核酸类药物也是适用的，如果生殖风险比较明确，也不需要开展额外的非临床生殖毒性研究。
致癌性试验
参照ICH S1A、S1B和S1C。如果从药物作用机制或重复给药毒性试验结果、遗传毒性结果、杂交依赖的脱靶毒性结果等提示有致癌风险，则需要谨慎考虑临床获益和风险，及致癌试验策略。通常组合是大鼠2年+转基因小鼠6个月致癌性研究。
局部耐受性
考虑伴随重复给药毒性试验进行，不需单独开展。
免疫毒性和免疫原性研究
免疫毒性参照ICH S8，通常不建议单独开展，可伴随在重复给药毒性试验中考察。可以考虑开展体外在人全血或PBMC中的促炎作用考察。
因寡核苷酸类药物也具有部分生物药的性质，需考察免疫原性风险，可参照生物药要求建立检测方法，伴随在重复给药毒性试验中考察。
光毒性研究
如果有光安全性担忧，可参照ICH S10进行。
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