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Introduction
子宫内膜癌作为女性生殖道恶性肿瘤，每年的发病率约为1%，远高于乳腺癌（0.5%）。特别是在美国、欧洲等发达国家和地区，其发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中居首位。根据2021年的最新统计，仅美国就报告了66570例子宫内膜癌新发病例和12940例死亡。尽管医疗不断进步，但过去20年的数据显示，死亡率从1997—2008年的每年0.3%加速至2008—2018年的每年1.9%，是发病率增长速度的两倍。更令人担忧的是，子宫内膜癌的发病率在年轻一代中急剧增加，这在很大程度上反映了该癌症缺乏研究突破和治疗进展。而化疗方法对子宫内膜癌的临床疗效表现不一，提示可以靶向与细胞死亡、治疗敏感性和耐药性相关的特定细胞过程（如自噬）的新型分子疗法，以提高子宫内膜癌治疗的疗效。
在我国药食同源目录中，黄精（ Polygonatum sibiricum，PS）的肉质根茎兼具药理和营养特性。黄精属在传统医学中的使用与女性生殖障碍以及癌症相关。薯蓣皂苷，黄精中的天然甾体皂苷，被报道有望避免与激素替代疗法相关的副作用，从而减少子宫内膜癌的风险。一些研究表明薯蓣皂苷抑制多种癌细胞的增殖与调节细胞凋亡、自噬等生物过程密切相关。自噬和凋亡对恶性细胞生存或死亡的复杂交互、相互作用和调控，为多种肿瘤的治疗带来了突破。研究表明，细胞中的营养情况和代谢活动，包括蛋白酶体损伤，蛋白聚集，以及损伤的细胞器等，都会影响自噬的发生。同时，外界应激或刺激引起的内质网和线粒体功能障碍、DNA损伤和氧化应激也可导致自噬的高效诱导。越来越多的证据表明，自噬通过调节多种信号通路而触发，参与多种癌症的肿瘤抑制。然而，黄精薯蓣皂苷是否可以通过激活这一过程影响子宫内膜癌细胞尚不清楚。
天然化合物或植物化学物质调控miRNA介导的基因表达在恶性肿瘤治疗中的积极反应，为临床治疗提供了潜在的分子靶点。然而，从miRNA组学角度阐明薯蓣皂苷对子宫内膜癌的作用及调控机制目前尚未见研究。
安徽理工大学公共卫学院李晓丽、北方民族大学生物科学与工程学院魏兆军教授等在本文基于miRNA组学数据，探索了薯蓣皂苷通过不同信号通路之间的动态相互影响对子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡和自噬的诱导作用。此外，还筛选了功能性miRNA及其靶基因，以针对这些分子靶点制定新的治疗策略。
Results and Discussion
薯蓣皂苷抑制肿瘤生长
体内实验结果表明，用薯蓣皂苷治疗3周后肿瘤大小被显著抑制（ P＜0.01）。此外，实验期间治疗组和对照组中的小鼠，体质量呈现良好自然的上升趋势，显示小鼠生长活动状态良好。与对照组相比，在薯蓣皂苷（24 mg/kg）治疗结束后，肿瘤体积和重量显著降低（ P＜0.01）。此外，组织学分析结果显示薯蓣皂苷处理的肿瘤组织出现明显的组织紊乱和较大的坏死区域。另外，薯蓣皂苷处理组移植瘤中tunel阳性细胞明显多于对照组。这些结果证实了薯蓣皂苷对体内子宫内膜肿瘤生长的抑制作用，并表明其与Ishikawa细胞凋亡的诱导有关。
图1 薯蓣皂苷（24 mg/kg）抑制异种移植模型的肿瘤生长
显著差异表达miRNA的靶基因的功能注释和富集分析
基于高通量测序数据，对显著差异表达miRNA的靶基因进行了功能富集分析。以 P＜0.05，|log 2 fold-change|＞1为筛选条件，共鉴定出62个显著差异miRNA。其中，25个miRNA表达上调，37个miRNA表达下调。GO_Term功能注释结果表明，显著差异表达miRNA的靶基因主要涉及参与信号转导过程、蛋白质结合作用以及膜、质和核等组分。KEGG富集结果显示，差异显著miRNA的靶基因主要富集在PI3K/AKT、p53和自噬信号通路。
薯蓣皂苷诱导细胞凋亡和自噬
结合组学富集通路主要涉及自噬-凋亡相互调节信号通路，进一步通过肿瘤免疫组织化学证实薯蓣皂苷对Ishikawa细胞凋亡和自噬的影响。结果显示DAPI染色中亮蓝色细胞的增加表明薯蓣皂苷确实触发了细胞凋亡。LC3染色中红光的增强也初步表明薯蓣皂苷调节细胞自噬相关的活性。此外，经薯蓣皂苷处理后，Ishikawa细胞中自噬溶酶体的显著增加（图3B）。进一步在体内和体外翻译水平检测了薯蓣皂苷对细胞凋亡和自噬标志蛋白表达的影响（图4）。结果表明薯蓣皂苷能促进Ishikawa细胞的凋亡和自噬。
图4 薯蓣皂苷调节Ishikawa细胞凋亡及自噬蛋白的表达
薯蓣皂苷对PI3K/AKT和p53信号通路的影响
薯蓣皂苷下调了Ishikawa细胞和小鼠肿瘤中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR的表达。免疫组化结果也证实了体内p-AKT蛋白水平降低。使用AKT抑制剂和AKT磷酸化激活剂（SC79）检测了凋亡和自噬标志蛋白（图5D），证实了薯蓣皂苷通过抑制PI3K/AKT通路促进Ishikawa细胞的凋亡和自噬。
Ishikawa细胞和肿瘤组织中p53蛋白表达降低、而磷酸化p53蛋白表达增强、MDM2蛋白表达的降低和GADD45a蛋白表达的增强证实薯蓣皂苷激活了p53信号通路。免疫组化结果也显示薯蓣皂苷处理组肿瘤组织中p-p53蛋白表达增强。此外，使用p53抑制剂能够显著抑制薯蓣皂苷诱导的自噬流增加，而在p53通路被抑制后，Caspase 3没有明显变化，但随后被薯蓣皂苷处理激活。这表明薯蓣皂苷诱导的p53通路主要参与影响Ishikawa细胞的自噬过程，而不是明显主导凋亡过程。
图6 免疫印迹分析p53信号通路蛋白
薯蓣皂苷诱导细胞自噬和细胞凋亡之间的关系
进一步采用自噬抑制剂，探究薯蓣皂苷介导的自噬与凋亡之间的关系。结果进一步提示在Ishikawa细胞中，自噬与凋亡之间存在着相互拮抗的关系。
miRNA和mRNA的验证和调控
RT-qPCR在体外和体内的验证结果显示了组学结果的一致性和可靠性。建立了miRNA与其潜在靶基因之间的miRNA-mRNA调控网络关系图。其中，miR-1260、miR-1246、miR-940和miR-9933的连接较明显，表明它们可能在薯蓣皂苷调控的PI3K/AKT和p53信号通路中占据关键位置。
图8 miRNA和mRNA的验证和调控
Conclusion
通过抑制细胞活力和肿瘤生长确定了薯蓣皂苷的抗子宫内膜癌活性，基于miRNA组学数据富集分析，通过体内和体外验证实验，阐明了PI3K/AKT和p53信号通路对Ishikawa细胞凋亡和自噬的交互调控作用。结果表明薯蓣皂苷通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路促进Ishikawa细胞的凋亡和自噬，并通过激活p53信号通路主导自噬。抑制自噬可以促进dioscin诱导的细胞凋亡。最终进一步筛选了功能性miRNA，为探索薯蓣皂苷抗子宫内膜癌活性的新治疗策略奠定了基础。
01
第一作者
李晓丽，女，工学博士，安徽理工大学公共卫生学院讲师。2016年本科毕业于安徽农业大学茶学专业，获得学士学位；先后于2019年、2023年在合肥工业大学食品与生物工程学院食品科学专业获得硕士和博士学位。主要的研究方向为食品功能因子活性和机理研究、纳米颗粒的肿瘤靶向递送研究。目前已经在 Critical Reviews in Food Science and Nutrition、International Journal of Biological Macromolecules、Food Science and Human Wellness、Food and Chemical Toxicology、Journal of Ethnopharmacology等期刊发表高水平SCI论文15篇，其中第一作者8篇，累计影响因子近60分，发表专利1项。
02
通信作者
魏兆军二级教授、博士、博士生导师。北方民族大学生物科学与工程学院院长。教育部食品科学与工程专业教学指导委员会委员；享受国务院政府特殊津贴、宁夏高等学校特聘教授、教育部新世纪优秀人才、安徽省杰出青年基金获得者、黄山学者特聘教授。国家自然科学基金、教育部科技项目、国家留学基金委基金、十余个省基金项目评审专家；国家科技进步奖、教育部科技进步奖等评审专家； Trends in Food Science & Technology、Food Chemistry、Industrial Crops and Products等国内外50余期刊审稿人。 Frontiers in Nutrition副主编、 Current Topics in Nutraceutical Research副主编、Agri-Waste & Agri-Byproduct Journal主编、《食品科学》编委；先后获得国家科学技术进步二等奖，中国农业科学院科技进步二等奖，农业部科学技术进步一等奖，安徽省科技进步三等奖等。主持国家重点研发计划项目课题、国家自然科学基金、安徽省科技重大专项等科研项目30余项。以第一或者通信作者在 Trends in Food Science & Technology、Food Chemistry、Industrial Crops and Products、Food and Chemical Toxicology发表高水平论文248篇；出版专著和教材8本，授权或申请专利30余件。研究方向为农林特产功能性食品加工和真核生物功能基因表达调控。
03
通信作者
章建国1979年4月出生，博士、副教授、硕士研究生导师。先后于2001年、2004年在华中农业大学获得学士和硕士学位、2017年在合肥工业大学获得博士学位。主要研究方向为食品生物技术、功能食品因子。主持或参加国家及省级科研项目20余项，主持横向课题“丙氨酸在食品领域中的应用研究”；参与安徽省重大科技专项项目“出口型面包屑加工关键技术研究及产业化示范”、“皖南特色林产品保鲜及精深加工关键技术研究与产业化示范”、“铜陵白姜规模化标准化精深加工关键技术研究及产业化示范”、安徽省重点研发计划项目“全营养豆奶干法制浆关键技术研究及产业化”、“高品质牡丹籽油绿色加工新工艺开发及副产物高值化利用技术研究”等。目前已经以第一作者或通讯作者发表SCI论文50余篇，授权或申请专利20余件。
Dioscin from Polygonatum sibiricum induces apoptosis and autophagy in Ishikawa human endometrial cancer cell and in vivo
Xiaoli Lia,b,c, Runhui Maa,b, Zhijing Nia, Wei Wanga, Kiran Thakura,b, Jianguo Zhanga,b,*, Zhaojun Weia,b,*
a School of Biological Science and Engineering, North Minzu University, Yinchuan 750021, China
b School of Food and Biological Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China
c School of Public Health, Anhui University of Science and Technology, Huainan 232001, China
*Corresponding author.
Abstract
With an aim to comprehend the precise regulatory mechanism of dioscin against endometrial carcinoma (EC), we firstly extracted the components from Polygonatum sibiricum followed by identification and structural characterization. The anti-EC activity of dioscin was initially determined based on the inhibition of Ishikawa cell proliferation and tumor growth. The high-throughput sequencing data indicated that dioscin not only promoted apoptosis, including decrease of poly ADP-ribose polymerase (PARP) and B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) and increase of c-PARP and Bcl-2-associcated agonist of cell death (Bad), but also induced autophagy, including increase of autophagic lysosomes and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio. Mechanistic exploration suggested that dioscin induced autophagy and apoptosis through inhibition of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway. Besides, the dioscin-regulated p53 pathway was mainly involved in autophagy induction. Furthermore, inhibition of Ishikawa cell autophagy was linked to dioscin-induced apoptosis. Our data suggest the immense potential of dioscin for the development of functional food for EC and related medical application.
Reference:
LI X L, MA R H, NI Z J, et al. Dioscin from Polygonatum sibiricum induces apoptosis and autophagy in Ishikawa human endometrial cancer cell and in vivo[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(5): 2601-2616. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250209.
本文编译内容由作者提供
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片来源：图虫创意
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