2024年12月23日，清华大学药学院肖百龙教授课题组、生命学院李雪明研究员课题组与药学院田博学研究员课题组合作，在Neuron杂志在线发表了题为An intermediate open structure reveals the gating transition of the mechanically activated PIEZO1 channel（中间开放态结构揭示机械激活PIEZO1 通道的门控转换）的研究长文，解析了机械力受体PIEZO1的中间开放状态的结构，揭示了其精细结构动态变化和门控转换过程，并结合结构分析、分子动力学模拟和电生理实验，定义了其关闭态、开放态和失活态的不同构象状态，提出了其门控循环机制，完善了其曲率感知理论学说。
PIEZO是一类专门的机械力受体，具有将多种形式的机械刺激转导成阳离子内流的能力。PIEZO蛋白凭借其纳米尺度的曲率形变，能够感受皮牛尺度的力，并在毫秒尺度被激活，随后快速失活。这种出色的机械敏感性使得PIEZO蛋白在多种细胞中发挥重要的机械信号转导功能，进而调控了触觉、本体感觉、机械痛痒觉、血压、心率和性快感等众多生理过程。PIEZO蛋白在受力时可以从关闭状态迅速转换至开放状态，随后快速进入失活状态。PIEZO蛋白的精细门控调节可能对应着其发挥的广泛生理和病理作用。例如：在体内一些细胞类型中，内源的PIEZO1介导电流的失活速度相较于异源表达的PIEZO1显著减慢；PIEZO1的一些功能获得性突变的人类致病位点往往具有电流失活变慢的特点。因此，确定PIEZO不同功能状态的结构对于在分子层面上深入理解其门控过程至关重要。
肖百龙团队和李雪明团队先前的研究揭示了PIEZO蛋白以同源三聚体的形式组成三叶螺旋桨样结构，带有帽子结构 （Cap） 的离子孔道位于三聚体中央。在先前使用去垢剂解析的PIEZO1结构中，三个桨叶 （Blade） 高度弯曲成碗状，称之为“纳米碗”，此时帽子结构处于向上位置且帽子门 （Cap-gate） 关闭，与帽子门相连的弹簧连接器 （Spring-linker） 处于放松状态，离子孔道的疏水跨膜孔径较小且被认为处于关闭状态，无法浸润和渗透离子，细胞内侧的杠杆结构 （Beam） 没有弯折，侧向门塞 （Lateral plug） 也被堵塞。这类弯曲的构象有可能代表PIEZO1的关闭构象 （图1上） (Nature 2018, Nature 2019, Neuron 2020) 。
在利用脂质体-膜蛋白重组体系，引入由质膜与重组蛋白曲率差异而产生的作用力后，研究者进一步解析出了PIEZO1蛋白的受力展平构象，此时桨叶完全被压平，同时帽子结构处于向上位置且帽子门关闭，弹簧连接器处于放松状态，跨膜孔道部分扩张，细胞内侧的杠杆结构弯折，侧向门塞处于堵塞状态。鉴于此结构下PIEZO1蛋白持续受力，因此该展平构象很可能处于失活状态 （图1下）（Nature 2022） 。
PIEZO通道毫秒尺度的动力学特征使其难以稳定在开放状态，因此对于解析其开放状态结构带来了非常大的挑战。本研究首先鉴定到一个位于离子孔道疏水跨膜区的点突变PIEZO1-S2472E，其电生理特性表现出更高的自发开放电流和更慢的电流失活速度，提示PIEZO1-S2472E突变体可能通过减缓PIEZO1向失活状态的转变而稳定在开放状态。研究者克服了PIEZO1-S2472E蛋白纯化得率低的难题，使用冷冻电镜解析出其三类构象状态的结构：第一类构象与PIEZO1弯曲结构类似，被称为S2472E-Curved；第二类构象的桨叶区高度介于弯曲构象和展平构象之间，帽子结构域处于向下位置，被称为S2472E-Intermediate，代表中间开放构象状态；第三类构象的桨叶区被完全压平，且帽子结构处于向下位置，被称为S2472E-Flattened，可能代表完全开放构象状态，但该类别占比较低，分辨率难以提高。
研究者重点分析了S2472E-Intermediate构象，其桨叶区部分展平，桨叶高度介于关闭态和失活态之间，胞外帽子发生旋转且向下移动，进而压缩了下方相连的弹簧连接器，帽子门和疏水跨膜门被打开，胞内侧的杠杆结构发生一定程度的弯折，然而此时侧向门塞仍然保持堵塞。结合分子动力学模拟，研究者认为此构象处于中间开放状态 （图1中） 。
图1 PIEZO1关闭、中间开放与失活的结构机制示意图
综合对PIEZO1和PIEZO1-S2472E系列结构的分析、突变和电生理学实验以及分子动力学模拟等证据，研究者定义了PIEZO1的关闭状态、中间开放状态和失活状态的结构特征，完善了PIEZO1的形变与曲率门控模型 （图2） 。
1.PIEZO1-Curved和S2472E-Curved结构代表PIEZO1的关闭状态，此时PIEZO1桨叶区呈高度弯曲状，PIEZO1纳米碗曲率半径约为10-14nm，帽子在向上位置且全部门控位点关闭。
2.S2472E-Intermediate结构代表PIEZO1的中间开放状态，此时帽子在向下位置且发生旋转，桨叶区部分下压，曲率半径约为32nm，杠杆结构发生部分弯折，帽子门和跨膜门打开，离子能渗透通过中心孔道，但侧塞门仍然保持关闭。
3.在研究者预测的开放状态S2472E-Flattened中，帽子仍处在向下位置，桨叶区彻底展平，包括侧塞门在内的所有门控位点全部打开。
4.PIEZO1-Flattened结构代表PIEZO1的失活态，此时桨叶区依旧保持展平，曲率半径约为117nm，但帽子位于向上位置，弹簧连接器舒展，各个门控逐步关闭。
图2 PIEZO1的形变与曲率门控模型
肖百龙教授、李雪明研究员和田博学研究员为本研究的共同通讯作者，李雪明课题组已毕业学生刘斯嘉博士、肖百龙课题组已毕业学生杨旭中博士、肖百龙课题组在读博士生陈旭东、田博学课题组在读博士生张孝春和肖百龙课题组已毕业学生姜京徽博士为共同第一作者。另外，肖百龙课题组的原静怡、刘文豪博士、王莉博士、吴坤博士和李雪明课题组的周珩博士也参与了部分工作。
https://www.cell.com/neuron/abstract/S0896-6273(24)00877-8
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