在文献中，我们经常看到由蓝色、绿色和红色信号组成的组织或细胞图片，不仅可以告诉我们目标蛋白在哪里表达、表达量如何变化，还可以看到不同蛋白或细胞是否存在空间上的邻近关系。这项技术就是免疫荧光。
免疫荧光常常有背景过高、信号过弱或假阳性的问题。本篇将从实验原理出发，系统介绍免疫荧光的操作流程、关键注意事项、结果分析方法及其在科研课题中的应用。
什么是免疫荧光？
免疫荧光，英文为 immunofluorescence，简称 IF，是利用抗原与抗体特异性结合，并通过荧光基团显示目标分子位置和表达情况的一种实验技术。
可以概括为：目标蛋白作为抗原→ 一抗特异性识别目标蛋白→ 荧光标记显示抗体结合位置→ 显微镜采集荧光信号→ 判断目标蛋白的表达与空间分布。
免疫荧光既可以用于培养细胞，也可以用于石蜡切片、冰冻切片、类器官和部分三维组织。与 Western blot 相比，免疫荧光不仅能判断蛋白是否表达，还能观察蛋白位于细胞核、细胞质、细胞膜还是细胞器中。与传统免疫组化相比，免疫荧光更适合同时检测多个指标，并进行共定位和空间关系分析。
图 1：https：//www.muhn.edu.cn/ecmd/info/1502/14885.htm
免疫荧光的直接法与间接法
1、直接免疫荧光
直接法使用带有荧光标记的一抗识别目标蛋白：目标蛋白＋荧光标记一抗。
它的优点是步骤少、时间短，能够减少二抗引起的非特异性背景；不足是信号放大能力较弱，而且每一种一抗都需要单独进行荧光标记。直接法常用于抗体已经完成荧光偶联，或者实验步骤需要尽量简化的情况。
2、间接免疫荧光
间接法先使用未标记的一抗识别目标蛋白，再使用带有荧光标记的二抗识别一抗：目标蛋白＋一抗＋荧光标记二抗。
由于多个二抗可以结合到同一个一抗上，因此间接法具有一定的信号放大作用，大多数常规免疫荧光实验采用这种方法。
但使用间接法时必须注意：
二抗应与一抗的宿主来源相匹配；
二抗不能与样本组织产生明显交叉反应；
多重染色时，不同一抗应尽量来自不同物种。
例如，一抗是兔源抗体，则应选择抗兔 IgG 荧光二抗；如果一抗是小鼠源抗体，则应选择抗小鼠 IgG 荧光二抗。
图 2：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/21857847022
免疫荧光可以检测什么？
免疫荧光常见的检测内容包括以下几类。
1、蛋白表达水平
比较不同处理组中目标蛋白荧光强度或阳性细胞比例的变化。
例如：药物处理后目标蛋白是否降低；基因敲低后蛋白表达是否减少；肿瘤组织中的蛋白是否高于癌旁组织。
图 3：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/2002845702775148720
2、亚细胞定位
判断目标蛋白位于细胞核、细胞质、细胞膜或某类细胞器。
例如：转录因子是否由细胞质进入细胞核；受体是否位于细胞膜；蛋白是否定位于线粒体或溶酶体；药物处理是否改变蛋白的亚细胞分布。
图 4：https：//www.sohu.com/a/141405600_749000
3、蛋白共定位
同时检测两个或多个蛋白，观察其荧光信号是否在空间上重叠。
例如：目标蛋白是否与线粒体标志物共定位；某受体与配体是否位于相同区域；两种蛋白是否可能存在空间上的接近。
需要注意，荧光共定位只能说明两个信号在显微镜分辨率范围内发生重叠，不能单独证明两个蛋白直接结合。蛋白相互作用仍需结合 Co-IP、PLA、FRET 或其他实验验证。
图 5：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/58194789
4、细胞类型鉴定
在组织切片中，可以将目标蛋白与细胞类型标志物共同染色，判断其主要由哪类细胞表达。
例如：CD68、CD163 或 F4/80 标记巨噬细胞；CD3 标记 T 细胞；CD8 标记细胞毒性 T 细胞；FOXP3 标记调节性 T 细胞；α-SMA 或 FAP 标记活化成纤维细胞；CD31 或 EMCN 标记血管内皮细胞；LYVE1、PDPN 或 PROX1 标记淋巴内皮细胞。
标志物的选择必须结合物种、组织类型和研究问题，不能仅依赖单个标志物就对复杂细胞亚群作出绝对判断。
图 6：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/598586689
实验开始前需要准备什么？
1、明确样本类型
常见样本包括：细胞爬片；石蜡组织切片；冰冻组织切片；细胞涂片；类器官；三维培养样本。不同样本的固定、抗原修复和通透条件不同，不能使用完全相同的实验流程。
2、确认抗体是否适用于免疫荧光
购买一抗时，应查看抗体说明书是否标注可用于 IF、ICC 或 IHC-F。同一个抗体可能适用于 Western blot，却不一定适用于免疫荧光。因为 Western blot 检测的是变性后的蛋白，而免疫荧光识别的是固定样本中的空间表位。
实验前应确认：抗体适用物种；抗体适用实验类型；一抗宿主来源；推荐稀释比例；目标蛋白的理论定位；是否有公开文献或验证图片支持。
3、设计必要的对照
一套可靠的免疫荧光实验至少应考虑：阳性对照；阴性组织或阴性细胞对照；不加一抗的二抗对照；基因敲低或敲除对照；单染对照；多色实验中的串色对照；自发荧光对照。其中，基因敲低或敲除样本通常是评价抗体特异性最有说服力的对照之一。
细胞免疫荧光的基本流程
细胞免疫荧光通常包括以下步骤：细胞爬片→ 固定→ 通透→ 封闭→ 一抗孵育→ 二抗孵育→ 核染色→ 封片→ 显微镜观察。
图 7：AI 做图
第一步：细胞接种与爬片
将无菌盖玻片放入培养板中，再接种细胞。待细胞贴壁并达到合适密度后进行处理和染色。细胞密度不宜过高。一般应保证细胞分布均匀，并能清晰分辨单个细胞。
常见问题：如果细胞过度融合：单个细胞边界难以辨认；细胞重叠会影响荧光定量；蛋白定位可能发生改变；高背景更难排查。
第二步：固定
固定的目的是保持细胞结构，并将蛋白稳定在原有位置。常用固定方法包括：4%多聚甲醛固定，4%多聚甲醛适用于多数细胞结构和蛋白定位实验；甲醇既能固定又具有通透作用，但可能破坏部分膜结构和构象表位。
常见问题：固定并非时间越长越好。过度固定可能导致：抗原表位被遮蔽；抗体难以结合；背景升高；荧光信号减弱。应根据目标蛋白定位和抗体说明书选择条件。
第三步：通透
如果目标蛋白位于细胞质、细胞核或细胞器内部，需要使用通透剂使抗体进入细胞。常见通透剂包括：TritonX-100；Tween-20；Saponin；低浓度 NP-40。TritonX-100 通透能力较强，常用于核蛋白和胞内蛋白；Saponin 作用相对温和，适用于需要较好保留细胞膜结构的实验。
如果目标蛋白位于细胞膜表面，并希望观察其天然膜定位，通透步骤应谨慎，必要时可以不通透。
常见问题：通透过强可能造成膜蛋白流失、细胞结构破坏或可溶性蛋白被洗脱。
第四步：封闭
封闭的目的是减少抗体与样本中非目标位点的非特异性结合。
常用封闭液包括：正常山羊血清；正常驴血清；牛血清白蛋白；与二抗宿主相匹配的正常血清。封闭液的选择通常与二抗来源有关。例如，使用驴抗兔二抗时，可考虑使用正常驴血清封闭。
常见问题：封闭时间和封闭液浓度并不是越高越好。某些封闭成分可能干扰特定抗原，应结合抗体说明书进行优化。
第五步：一抗孵育
按照预实验确定的稀释比例配制一抗，覆盖样本并进行孵育。常见做法是在 4℃条件下孵育过夜。
常见问题：一抗浓度过高容易造成：背景荧光升高；非特异性染色；细胞轮廓模糊。
一抗浓度过低则可能造成：信号过弱；阳性细胞漏检；组间差异难以观察。
因此，正式实验前最好设置梯度，例如在说明书推荐范围内比较多个稀释比例，并同时观察特异信号与背景。
第六步：清洗
一抗孵育完成后，使用 PBS 或含少量 Tween-20 的缓冲液清洗。
清洗不足是高背景的常见原因之一；清洗过于剧烈，则可能导致细胞脱落或组织结构损伤。
整个过程中应避免样本干片。一旦样本局部干燥，往往会产生强烈而不均匀的背景荧光。
第七步：二抗孵育
选择与一抗宿主匹配的荧光二抗，并在避光条件下孵育。
例如：兔源一抗对应抗兔二抗；小鼠源一抗对应抗小鼠二抗；山羊源一抗对应抗山羊二抗。
二抗孵育开始后，应尽量全程避光。二抗浓度过高同样可能造成背景升高，因此需要进行适当稀释。
第八步：细胞核染色
DAPI 或 Hoechst 常用于细胞核染色。DAPI 与 DNA 结合后发出蓝色荧光，可用于显示细胞核的位置和数量。
常见问题：核染时间不宜过长、浓度不宜过高，否则蓝色信号过强，可能干扰相邻通道的观察。
DAPI 只用于显示细胞核，并不能区分正常细胞核、凋亡细胞核或不同类型的细胞，除非结合形态和其他指标分析。
第九步：封片与拍照
滴加抗荧光淬灭封片剂后，将盖玻片固定于载玻片上，并避免产生气泡。
封片后应尽快观察，或在避光、低温条件下妥善保存。不同荧光染料的稳定性不同，长时间放置可能导致信号衰减。
图 8：AI 做图
显微镜拍照有哪些要点？
免疫荧光结果不仅取决于染色，还取决于图像采集。
1、同一实验采用相同参数。
如果每张图片都单独调整亮度和曝光，组间荧光强度就失去了直接可比性。
2、避免信号饱和
当荧光信号达到检测上限后，即使真实表达进一步升高，图片中的亮度也不会继续增加。因此，拍照时应检查是否存在过曝或饱和像素。用于定量的图片尤其不能大面积过曝。
3、不要只选择「最好看」的视野
应提前制定取景规则，例如：
• 每张切片随机选择若干视野；
• 按照肿瘤核心区和浸润边缘分别取景；
• 避开折叠、坏死和严重破损区域；
• 由不知道分组信息的人员完成拍摄或分析；
• 以患者或动物，而不是视野数量作为统计单位。
一名患者拍摄 10 个视野，并不等于获得了 10 个独立样本。
免疫荧光结果如何定量？
免疫荧光不能只放代表性图片，还应进行客观定量。
常见指标包括：平均荧光强度；积分光密度；阳性面积比例；阳性细胞比例；单细胞荧光强度；核质荧光比；单位面积阳性细胞数；两类细胞之间的距离；共定位系数。
1、平均荧光强度
• 用途：评估不同组别间目标蛋白的整体表达水平。
要求：严格统一感兴趣区域界定、背景扣除、曝光参数、阈值及图像处理全流程。
2、阳性细胞比例
• 用途：量化表达目标蛋白的细胞占比（目标蛋白阳性细胞数 / 总细胞数）。
• 要点：常用 DAPI 计数总细胞，遇细胞密集或重叠时需借助分割算法识别。
3、核质比
用途：反映存在核转位蛋白（如 NF-κB、STAT、YAP、β-catenin 等）入核的程度。
• 方法：分别测定胞核与胞质的荧光强度并计算比值。
4、共定位分析
• 指标：常用 Pearson 相关系数和 Manders 重叠系数。
• 干扰因素：易受背景荧光、通道串色、阈值设置及图像分辨率的影响。
图 9：AI 做图
实验中常见问题及解决思路
1、无荧光信号
核心诱因：抗体不匹配/失效/浓度低、抗原修复或固定不当、蛋白低表达、染料淬灭、滤光通道选错。
排查策略：首选已知阳性样本验证抗体及显色系统有效性。
2、背景过高
核心诱因：抗体过浓、封闭不足、清洗不净、实验干片、非特异结合、自发荧光、曝光过度。
排查策略：降低抗体浓度、强化清洗与封闭、做无一抗阴性对照、淬灭自发荧光。
3、信号弥漫无特异定位
核心诱因：固定不足、通透过度（导致蛋白游离）、抗体特异性差、过曝、散焦。
排查策略：定位与预期严重不符时，优先重检抗体特异性并优化固定/透化条件。
4、细胞或组织脱落
核心诱因：贴壁/烤片不充分、玻片未做防脱处理、抗原修复过度、清洗用力过猛。
排查策略：改用包被/防脱载玻片，温和洗涤，优化烤片时长与修复条件。
5、多色荧光串色
核心诱因：发射光谱重叠、二抗交叉反应、通道荧光过强、滤光及拍摄参数不当、缺单染补偿。
排查策略：从源头严选抗体宿主与染料组合，规范设置单染对照与通道拆分，切勿仅依赖后期处理。
编辑：小 z
题图：自制
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