责编 | 酶美

活细胞单分子追踪技术（Single Molecule Tracking，SMT）是利用高分辨荧光显微镜对细胞内单个特定分子进行定位和追踪。由于SMT技术能够实时监控某种分子（如蛋白，核酸）在活细胞内的动态，这项技术为研究分子功能，结构，以及分子间的相互作用提供了重要的动力学依据。尽管SMT技术发展迅速，目前的研究通常只能追踪某一种分子的运动轨迹。在活细胞内对多种单分子进行实时追踪还存在着样品标记、光学设计和数据分析上的诸多难点。众所周知，蛋白相互作用是细胞信号传导的分子基础，这一缺陷阻碍了利用SMT技术在活细胞内研究分子信号通路的更广泛应用。

近日，陈忠文（前Jay Groves组博后，现任复旦大学研究员）与曹宇虹（前杨培东组博后，现任国家纳米中心研究员）合作在PNAS上发表题为Nanopore Mediated Protein Delivery Enabling 3-color Single Molecule Tracking in Living Cells的研究论文。这篇论文主要描述了利用一种新型纳米电穿孔技术（NanoEP，杨培东组在2018年中发表于PNAS：Nontoxic Nanopore Electroporation for Effective Intracellular Delivery of Biological Macromolecules），将体外提纯并标记荧光的少量蛋白分子递送输回细胞内，从而实现在细胞内同时追踪2到3种不同蛋白单分子（图1）。这项新方法为观测细胞内蛋白在信号传导中的相互作用提供了更高的时空分辨率。

图1

为验证该方法的可行性，作者追踪了细胞膜EGFR信号通路中的关键蛋白分子Grb2，SOS，和 Ras。课题组首先验证了通过纳米孔递送的在体外提纯并被荧光标记的Grb2蛋白具有与细胞内天然表达的Grb2相似的蛋白活性。在EGFR激活以后，细胞质中的Grb2结合到EGFR上并形成半径为160nm的团簇。多通道单分子追踪发现，SOS会晚于Grb2结合到EGFR上，揭示了EGFR:Grb2:SOS复合体形成的动态过程（图2）。而Ras并不会聚集于EGFR周围，提示被SOS激活的Ras会迅速在细胞膜扩散，因而作者提出EGFR受体激活后形成的团簇与Ras引起的下游MAPK信号传导在空间上是分隔开来的。

图2

最后，作者将该技术扩展到了小鼠原代T细胞。原代细胞往往难以转染，实现单分子成像的挑战更大。通过纳米电穿孔，作者成功实现了原代T细胞的蛋白递送与荧光成像，且细胞保持很好的活性（图3），极大拓展了该技术的应用范围。

图3

据悉，该研究系陈忠文博士和曹宇虹博士在美国加州大学伯克利分校进行博士后期间合作共同完成，加州大学伯克利分校的杨培东教授和Jay T. Groves教授为本文共同通讯作者。陈忠文（复旦大学）和曹宇虹（国家纳米科学中心）均已全职回国建立实验室。

https://www.pnas.org/content/118/5/e2012229118