机器长期正常运转离不开零部件的定期检修和更新。细胞也不例外。当细胞内蛋白质或细胞器出现损伤或变得多余时，细胞通常可以通过自噬予以清除和回收。自噬系统出现异常可能导致多种疾病。2021年6月24日，《新英格兰医学杂志》（NEJM）发表一项罕见病研究。通过对来自5个家系12个神经发育障碍患者外显子组序列的分析及细胞和动物实验，其作者首次确定了自噬关键基因ATG7隐性突变导致的罕见病。

上海市第十人民医院秦环龙教授、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心胡荣贵教授受邀点评这篇论文。

2016年诺贝尔生理或医学奖由日本科学家大隅良典（Yoshinori Ohsumi）获得，其贡献是发现了细胞自噬（autophagy）机制。在特定环境下，自噬作为机体细胞维持内稳态的重要机制，调控细胞内蛋白以及细胞器在溶酶体中降解以及回收利用。从上世纪50年代溶酶体首次被de Duve发现，到90年代自噬相关基因（autophagy-related genes，ATG）逐一阐明，我们对于自噬的理解也从单一的宏观现象观察跨越到了基因水平的探讨。在过去十年中，自噬研究又发生了质的飞跃，其已经从单纯的分子机制研究延伸到了多种威胁人类健康的疾病领域，如癌症、病原微生物感染以及老年痴呆等。

近期，来自英国纽卡斯尔大学的Jack J. Collier博士等人首次报道发现了来自5个不同背景家庭伴有复杂神经发育障碍性疾病的12位患者，他们均存在ATG7蛋白严重丢失甚至完全缺失，而其自噬功能都严重受损。鉴于自噬是真核生物生存的重要调控机制，这种先天性的隐性基因突变自噬相关疾病是极其罕见的。2021年6月24日，该研究以Developmental Consequences of Defective ATG7-Mediated Autophagy in Humans为题发表在《新英格兰医学杂志》（NEJM）[1]。

根据细胞内被降解物质投送到溶酶体的方式和生理功能的不同，哺乳细胞的自噬可分为三大类—“巨自噬”（marcoautophagy）、“微自噬”（microautophag y）以及分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA），其中巨自噬是研究最深入和最广泛的自噬途径[2]。从自噬的诱导和吞噬泡形成（initiation），自噬体（autophagosome）的延伸与形成（nucleation elongation maturation），到最后自噬体与溶酶体的融合（fusion）、降解与回收（degradation），自噬的整个过程都受到相关ATG的有序调控。目前已知的参与自噬溶酶体降解途径的ATG已经超过40个[3]。

在经典的双层膜样自噬体形成过程中，需要两个独立的类泛素连接系统（ATG12和LC3）进行调控，而ATG7作为泛素E1样连接酶，可以同时激活泛素样蛋白ATG12和LC3，将它们转运到对应的E2样酶上，并最终形成相应的ATG12-ATG5复合物以及磷脂酰乙醇胺化的LC3（LC3-PE）[4,5]。由于ATG7能够同时驱动这两种类泛素连接系统，所以ATG7类泛素E1酶的功能对自噬的调控至关重要。相关文献表明ATG7全敲除鼠一般在出生24小时内就死亡，即便是脑组织特异性ATG7缺陷鼠也存在着共济失调的症状[6,7]。

图1. 传统的自噬过程示意图[1]

在这项研究中，作者首先研究了来自5个不同家庭的12名患有共济失调以及发育迟缓症状的患者。临床诊断表明大部分患者具有小脑发育不全，后胼胝体偏薄，骨骼肌异常以及面部畸形等特征。通过基因测序发现这些患者都存在不同程度ATG7双等位基因的突变体。

图2. 入组患者的谱系图和典型特征[1]

因为近端肌无力是这些患者的一个显著临床表型，研究人员在2号患者来源的成肌细胞细胞中通过免疫印迹（Western blot）检测了ATG7的表达水平，但发现该型ATG7突变体蛋白表达量几乎检测不到。已知ATG7是下游LC3-Ⅰ脂质化转变成活化形式LC3-Ⅱ所必须的，所以ATG7缺失会引起LC3-Ⅱ的减少；而p62可作为将要被自噬作用降解的小泡的受体，带着底物和LC3-Ⅱ结合形成自噬体，而后在自噬体中p62被降解，所以在细胞内整体p62的水平和自噬活性呈负相关。Western blot结果与文献报道一致，即LC3-Ⅱ不足并且p62水平在突变体细胞中累积。在该患者的免疫组化标本中，研究人员也发现大量积累的p62。然而从整体病理水平上来看，患者2的肌纤维排列和形态并没有明显病变，只是在Ⅰ型纤维上存在一定的炎症。有意思的是，通过透射电镜，研究人员还是能够观察到自噬体的存在，并且在2号患者的姐妹1号患者的样本中也得到了验证。

图3. ATG7缺陷患者肌纤维发生轻微病变[1]

噬小体有一个生成、融合、降解的过程，即“自噬流”（autophagic flux），对自噬流的检测能够更好地监测自噬的变化。LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ的比例是判定自噬的金标准，但是单时间点LC3-Ⅱ的表达变化往往不能很好地体现自噬的动态变化，所以需要结合一些自噬阻断抑制剂，如氯喹或者巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1），判断在药物干预手段下自噬程度的改变，即自噬流的变化。研究人员采用经典的mTOR抑制剂AZD8055来激活自噬，同时应用抑制剂bafilomycin A1判断ATG7突变体细胞中自噬流的变化。结果表明，和健康对照相比，这5个不同遗传背景家庭的ATG7突变体患者的自噬流水平都被显著抑制。

乳酸脱氢酶（LDH）是细胞中可溶性高表达的胞浆蛋白，该蛋白能够被非选择性地降解。细胞发生自噬时能够封存细胞质中一部分可溶性蛋白，这些可溶性蛋白连同其他自噬底物被自噬体包裹降解。因此，通过检测纯化出来的被自噬体封存的LDH数量或者活性就能够很好地反应自噬体的数目。在该研究中，研究人员采用该手段发现ATG7突变患者的成纤维细胞中被自噬体包封的LDH水平显著地低于健康对照，该结果进一步证实不管是从自噬功能水平还是自噬体数目水平评价，ATG7的突变都会导致自噬的抑制。

蛋白结构往往决定蛋白功能，而蛋白结构又取决于其氨基酸的序列。在这项研究中，作者借助计算机辅助结构模拟的方法来评估ATG7突变体结构变化以及对功能的影响。他们发现，绝大部分ATG7突变体会影响ATG7蛋白的正确折叠，进而无法形成完整的同源二聚体以发挥正常功能。该结果通过ATG7突变蛋白在非变性蛋白胶上的条带得到了证实。

ATG7突变造成ATG7本身表达水平的降低，同时又减低了自身二聚体的形成，使其无法行使有效功能。为证实这种推理，研究者进行了功能回补实验。通过对来自突变体患者的成纤维细胞进行瞬时转染，研究者发现外源性野生型ATG7能够成功表达并且重塑自噬流。研究者进一步使用了ATG7全敲除鼠来源的MEF细胞，对其转染包括野生型在内的多种外源性ATG7突变载体，结果发现只有野生型的外源性ATG7能够较好地挽救细胞内的自噬流。考虑到自噬在真核生物体内的保守性，作者也在酿酒酵母模式生物中进行了验证，并得到了一致的结论。这些结果都表明ATG7的正确表达对自噬至关重要，ATG7突变会引起自噬障碍。

总之，这项研究在临床上验证了机体正常水平的自噬对于神经系统、骨骼肌以及内分泌系统的发育和功能都至关重要。该研究也提示，即使某些个体存在自噬功能缺陷，他们也能达到常规预期寿命。同样是ATG7突变，但是不同的突变位点产生的临床症状的类型和轻重也有所差别。更为重要的是，某些自噬核心蛋白的突变或者缺失并没有彻底阻止自噬体的形成，这说明相关自噬通路存在一定的冗沉性和容错率。

尽管人们早就意识到自噬失调会导致一系列人类疾病，但是对于先天性自噬缺陷相关孟德尔遗传病的认识目前还不是很清楚，对于这类疾病的研究也是近来才被报道发现。这种先天性的自噬相关疾病最大的临床学特征表现为神经性以及神经肌肉性异常。例如先前研究表明ATG5的突变会导致遗传性小脑共济失调。在这项研究中，研究人员也不出意外地发现ATG7的多种突变个体具有类似症状。

由于ATG7能够同时启动自噬通路中两个必要的类泛素激活系统，所以该基因的突变在自噬过程中又显得尤为重要。这项研究的结果首次报道了ATG7突变介导的自噬障碍能够引起先天性的神经系统发育障碍，强化了自噬系统中的ATG基因突变与先天性神经系统发育障碍的关联。同时，研究中提到在ATG7这个自噬必须因子突变的情况下，依旧能够观察到自噬体的存在，其中的机制值得深入研究。

虽然越来越多的神经系统发育性疾病的病因指向先天性自噬缺陷，但是这些疾病有时也会和溶酶体相关疾病和膜转运系统异常相关联。同时，很多ATG往往存在着非自噬调控的功能，所以在研究ATG突变引起的神经系统性疾病时需要格外谨慎。另外，仍然有很多问题等待我们进一步研究，例如：先天性自噬缺陷是如何导致最终的神经系统发育障碍？不同ATG突变产生的临床症状为何不尽相同？如何解决ATG突变胚胎致死使我们无法看到相关表型的问题？

最后，随着越来越多先天性自噬缺陷性疾病被报道，我们对于这类疾病的理解会不断加强。未来针对特定ATG突变的药物或者基因疗法或许能够为这些患者带来希望。

原文链接：https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1915722

作者介绍

秦环龙，主任医师、教授、博导，现任同济大学附属上海第十人民医院院长、上海市临床营养质控中心主任、同济大学肠道疾病研究所所长。学术兼职包括中华医学会肠外肠内营养分会候任主任委员，中国医促会和医师协会ERAS主任委员，《中华临床营养杂志》、《肠外与肠内营养》副主编等。享受国务院政府特殊津贴，国家卫健委突出贡献中青年专家，国家人社部百千万人才工程，上海市领军人才等。承担NSFC重点、面上项目等20余项。获得上海市科技进步一等奖一项，教育部科技成果一等奖二项，中华医学科技二等奖一项，上海医学科技一等奖一项。

吴伟军，药理学博士，上海市第十人民医院助理研究员。2019年毕业于复旦大学药学院，后赴美进行博后科研工作，2021年加入同济大学附属第十人民医院病理科。目前以一作或共一作发表多篇高水平SCI论文。主要研究领域为运用诱导多功能干细胞来源的类器官研究自闭症的发病机制以及肠脑轴的交互机制，同时采用基因编辑工具对遗传性肠脑疾病进行机制研究与修复。

胡荣贵，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员、中国科学院大学特聘教授。先后入选中科院百人计划、国家杰出青年、中青年科技创新领军人才等。主要致力于研究蛋白质稳态异常与重大疾病的机制，并发展一系列研究和操纵蛋白质稳态的原创性方法。课题组近年报道了一系列自闭症、中枢性性早熟等神经系统疾病的分子机制方面的进展。主要成果发表在Nature、Science、Cell Res、Cancer Cell、Nature Cancer、Nature Microbiology、J. Hepatology、PNAS等学术期刊。获国际 (3项)及中国（2项）专利授权，1项进入国际PCT、2项已受理。

参考文献

1.Collier JJ, Guissart C, Oláhová M, et al. Developmental consequences of defective ATG7-dediated autophagy in humans. N Engl J Med 2021;384:2406-2417.

2. Glick D, Barth S, Macleod KF. Autophagy: Cellular and molecular mechanisms. J Pathol 2010;221:3-12.

3. Li X, He S, Ma B. Autophagy and autophagy-related proteins in cancer. Mol Cancer 2020;19:12.