白酒是我国传统的民族特色饮料酒，酿造历史悠久，是以酒曲（大曲、小曲或麸曲）为糖化发酵剂，将谷物类原料（高粱、大米、糯米、玉米等）通过糖化发酵、蒸馏、贮存、勾兑而成的蒸馏酒。因糖化发酵剂种类、发酵原料、酿造环境及生产工艺等因素的差异，中国白酒可分为酱香型、浓香型、清香型、米香型等多种香型，以及近年发展起来的清酱香型。清酱香型白酒酿造工艺过程有机融合了酱香型、清香型白酒酿造工艺之精华，与清香型、酱香型白酒酿造工艺最大的差别在于清酱香型白酒采用多曲联用作为糖化发酵剂，不同于清香型白酒采用中温大曲作为唯一糖化发酵剂、酱香型白酒采用高温大曲作为唯一糖化发酵剂，因而形成了“清亮透明、清酱协调、香气幽雅、香醇厚丰满、细腻柔顺、回味悠长”的酒体风格，既具有清香型白酒的幽雅净爽，又具备酱香型白酒的醇厚丰满，回味和空杯留香，深受大众喜爱。

为解析清酱香型白酒酿造发酵过程中的细菌来源，贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室的左乾程、黄永光*等人对酿造环境微生物、酿造用曲的微生物、堆积发酵酒醅微生物、窖池发酵酒醅微生物进行比较分析，拟进一步揭示酿造过程微生物的不同来源及其对白酒发酵的贡献。本研究采用高通量测序技术及数理统计分析，对清酱香型白酒发酵过程细菌群落结构及其演替进行解析，并初步分析酒曲及环境中微生物对堆积发酵的贡献，对认识固态法白酒酿造的发酵机制，提升清酱香型白酒的产品质量、安全性及生产可控性具有重要意义。

1、发酵过程酒醅理化指标变化规律

由表1可知，发酵开始（0 d）时酒醅温度为（22.3±0.3）℃，发酵5 d后达到最大值，是由于发酵前期微生物生长繁殖产生的生物热所导致，之后呈下降趋势，主要原因是随着发酵的进行，酒醅中微生物数量下降，故而产生的热量降低所致。酒醅水分与还原糖则呈波动式变化。发酵过程酒醅酸度一直呈降低趋势，且在10～15 d阶段下降最快，主要是微生物代谢的结果，理化参数在影响微生物群落演替的同时也受微生物代谢影响。

2、α多样性分析

如表2所示，发酵开始（0 d）时酒醅中细菌的Shannon指数、OTU数目、Chao1指数最高，Simpson指数最低，表明此时酒醅中细菌物种多样性及丰富度最高，这是堆积过程曲中细菌增殖及网络环境中微生物的结果，该现象说明堆积发酵对清酱香型白酒酿造的重要意义，不仅能提高的微生物多样性，而且能增加微生物种类丰富度。0～20 d，细菌的Shannon指数、OTU数目、Chao1指数呈降低趋势，Simpson指数呈升高趋势；20～25 d，细菌群落的Shannon指数、OTU数目、Chao1指数出现部分升高，而Simpson指数出现部分降低。这说明在发酵过程中细菌群落的多样性及丰富度先降低后升高，总体上呈降低趋势。此外，从发酵5 d开始，酒醅中细菌群落的Shannon指数、OTU数目、Chao1及Simpson指数产生显著性差异（P＜0.05），发酵10 d开始，酒醅中细菌群落的Shannon指数、OTU数目、Chao1及Simpson指数产生极显著性差异（P＜0.05），说明发酵过程细菌群落结构的显著变化。

3、发酵过程细菌群落结构分析

从清酱香型白酒发酵过程中共检出14 个菌门，其中相对丰度大于0.1%的有Firmicutes、Proteobacteria、Cyanobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Fusobacteria、Epsilonbacteraeota、Verrucomicrobia及Patescibacteria（图2）。发酵开始（0 d）时，Firmicutes、Proteobacteria及Cyanobacteria 3 个菌门在酒醅中占主导地位，平均相对丰度大于10%，这与酱香型白酒、清香型白酒发酵过程主导菌门有所区别。此外，图2表明：发酵5 d之后，Firmicutes在酒醅中占绝对主导地位，相对丰度高达88.00%～99.36%。该结果与酱香型白酒、清香型白酒、浓香型白酒、芝麻香型白酒研究结论一致。

从清酱香型白酒发酵过程中共检出113 个细菌属，其中平均相对丰度前10为Lactobacillus、Bacillus、Weissella、Acetobacter、Gluconobacter、Pediococcus、Kroppenstedtia、Staphylococcus、Enterobacter、Scopulibacillus（图3），分别均占每个样品相对丰度的94.15%～99.94%。发酵开始（0 d）时，酒醅中Bacillus相对丰度最高（49.11%），依次是Weissella（12.05%）、Acetobacter（10.63%）、Gluconobacter（8.85%）、Pediococcus（3.27%）、Scopulibacillus（1.91%）、Enterobacter（1.61%）、Staphylococcus（1.50%）、Kroppenstedtia（1.50%）。发酵5 d后，Lactobacillus在酒醅中占主导作用，相对丰度为78.86%。而Bacillus相对丰度陡然降低至3.94%，Acetobacter、Staphylococcus、Enterobacter、Scopulibacillus也呈降低趋势。发酵10 d后，Lactobacillus在酒醅中占绝对主导作用，相对丰度高达96.68%～98.48%。

以上结果表明：清酱香型白酒发酵优势细菌属除具有清香型和酱香型白酒发酵的优势细菌属特征外，还具有自身的特有的优势细菌属。这也是清酱香型白酒酒体风格除了具有清香型、酱香型白酒的酒体风格特征外，还具备清酱香型白酒自身风格特点的原因之一。

4、发酵过程细菌群落结构与环境因素相关性

RDA结果表明，酒醅温度（对细菌群落结构贡献率为22.56%，P＜0.05）、水分（对细菌群落结构贡献率为17.5%，P＜0.05）、酸度（对细菌群落结构贡献率为16.8%，P＜0.05）及还原糖含量（对细菌群落结构贡献率为15.3%，P＜0.05）与细菌群落结构均存在显著相关，其中还原糖含量与温度、水分及酸度负相关（环境因子间的夹角为钝角），而与温度、水分、酸度之间正相关（环境因子间的夹角为锐角）。发酵开始时（0 d）时，酒醅中细菌群落结构受还原糖影响较大（还原糖含量对细菌群落结构贡献率为38.97%），这是因为发酵前期酒醅中微生物生长繁殖需要消耗较多的还原糖，发酵5 d之后，还原糖对细菌群落结构影响不大，这是因为这个阶段主要是乙醇发酵及产香阶段，微生物将前期产生的小分子化合物转化为乙醇及其他风味物质，还原糖浓度降低，因此受还原糖含量影响不大。发酵中后期（10～25 d）细菌群落结构主要受酸度的影响，该阶段细菌群落结构以Lactobacillus为主导，Lactobacillus会代谢产生乳酸、乙酸等有机酸，对细菌群落结构造成重要影响。如图4B所示，热图中的X轴和Y轴分别为环境因子和物种（属水平），通过计算获得R值和P值考察2 个（组）变量之间的相关程度。除乳酸菌与酸度高度显著正相关外，其他优势菌属几乎与酒醅酸度呈显著负相关，导致其他菌群结构丰度降低。

5、堆积发酵过程细菌群落结构主要来源分析

如图5A所示，环境样品（不添加酒曲）中优势细菌门与酒醅中（发酵0 d）优势菌门结构高度相似，表明环境微生物对白酒发酵具有重要贡献，这是长期酿造活动对酿造环境微生物的富集和结构优化的结果。酒醅及环境样品中都是Firmicutes、Proteobacteria、Cyanobacteria占主导地位，而酒曲中是Actinobacteria及Firmicutes占主导，推测酒醅中Cyanobacteria主要来自于环境。如图5B所示，Firmicutes、Proteobacteria、Cyanobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes 5 个菌门在酒醅、环境及酒曲都能检测到，而Fusobacteria仅在环境样品中检测到，同时该菌门在酒醅样品中被检测到，推测酒醅中的Fusobacteria仅来源于环境。此外，Chloroflexi和Verrucomicrobia 2 个菌门仅在酒曲中被检测，同时这2 个菌门在酒醅中能检测到，推测这2 个菌门仅由酒曲提供。

图6A展示了酒醅、酒曲及环境中共有及特有的细菌属数，结果显示酒醅中共有19 个细菌属来自于环境，占比为31.67%，有30 个属来自于酒曲，占比为50%，其中，有16 个属由酒曲及环境共同提供，占比为26.67%。此外，有3 个细菌属仅在酒醅及环境中检测到，占比为5%，推测该3 个菌属仅来自于环境；此外，有14 个细菌属仅在酒醅及酒曲中检测到，占比为23.33%，推测这14 个细菌属仅来自酒曲中。同时通过优势细菌属（平均相对丰度＞1%）分析，发现酿造环境中存在大量的白酒发酵功能细菌（图6B），如Lactobacillus、Bacillus、Weissella、Acetobacter等，而且环境中优势细菌属与酒醅中优势细菌具有较高的相似性，说明在堆积发酵过程网络了大量环境中的功能优势细菌属，进而论证了薄层堆积发酵对清酱香型白酒发酵的重要作用。此外，酒醅中的优势细菌属Gluconobacter仅在环境中被检测，推测该菌属仅由环境提供。

结论

通过分析比较酒醅样品（发酵0 d）、酒曲、环境样品（不添加大曲堆积酒醅）之间的细菌群落结构以说明酒醅中的细菌来源，结果表明门水平上酒醅中 Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes由大曲及环境提供，Cyanobacteria主要来自于环境，Fusobacteria仅由环境提供，Chloroflexi和Verrucomicrobia仅来自于大曲。属水平上酒醅中的细菌属有31.67%来自于环境，50%来自于酒曲，23.33%由酒曲及环境共同提供，5%只由环境提供。优势细菌属中Gluconobacter仅来自于环境。本研究系统解析了清酱香型白酒窖池发酵过程细菌群落结构，初步分析了堆积发酵过程酒醅中细菌来源，有助于完善白酒发酵微生态结构的研究，并对提升白酒产品质量、安全及生产可控性具有重要的意义。

本文《清酱香型白酒冬季发酵细菌群落演替及堆积过程细菌来源解析》来源于《食品科学》2021年42卷12期145-152页，作者：左乾程，黄永光，朱家合，马菜飞。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200420-251。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

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