酱油是以大豆、面粉等为主要原料，经微生物发酵而成的一种典型的传统调味食品，它具有香气浓郁、滋味丰富的特点，在人们日常生活中不可或缺。随着生活水平的提高，人们对调味品的口感、香气等方面提出了更高的要求。在酱油风味研究方面，主要有风味成分构成和风味物质形成机理两个重要研究方向。目前已鉴定得到超过300 种酱油的挥发性香气成分，这些挥发性香气成分相互作用，成为酱油重要特征香气成分的来源。
近年来，利用不同菌株混合培养或通过在发酵过程中添加菌株纯培养物强化食品发酵已成为改造传统食品发酵业研究热点。基于此，李锦记（新会）食品有限公司的邹谋勇、何理琴、孙启星等人从酱油发酵醪中分离筛选得到1 株产4-EG的酵母A10-2，采用生理生化测试和分子生物学方法对其鉴定，然后探究其在不同盐度培养基中的生长情况。通过底物添加实验，研究4-EG代谢合成途径。采用A10-2开发高4-EG含量的半成品，并应用于酱油调配，分析其对产品风味的影响。
1、产香酵母A10-2挥发性风味成分的鉴定
采用顶空固相微萃取-GC-MS对添加A10-2种子液连续发酵13 d的酱油发酵液进行挥发性物质分析，结果如图1所示。实验组挥发性成分中含有多种醇类物质，包括乙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇、β-乙基苯乙醇等，其中苯乙醇含量较高；对照组检出了乙醇和异戊醇，实验组检出峰面积相对较大，说明A10-2具有进一步合成乙醇、异戊醇的能力（表1）。
2、产香酵母A10-2形态特征
如图2a所示，产香酵母A10-2在麦芽汁平板上菌落淡黄色，奶油状，菌落边缘整齐暗淡无光泽。显微镜观察发现，A10-2均为球状或椭球状，菌体直径为1～5 μm，可见出芽生殖（图2b）。根据A10-2菌落形态和菌体显微镜观察初步推测其为酵母类微生物。
3、产香酵母A10-2生理生化鉴定
如表2所示，A10-2发酵葡萄糖能力较强，发酵半乳糖能力较弱，不能发酵木糖、阿拉伯糖、麦芽糖等糖类物质；除海藻糖、乳糖、赤藓糖外，能同化已测试的全部糖类，不能利用淀粉，可以同化甘露醇、乙醇和甘油。此外，A10-2可以同化硝酸钠，在37 ℃温度下能较好生长，在高盐（18% NaCl）环境中也能增殖，在无维生素培养中能缓慢生长，而脲酶、50%葡萄糖、1%乙酸测试均为阴性。
4、产香酵母A10-2分子生物学鉴定
为进一步鉴定A10-2的分类学地位，对其ITS rDNA序列进行克隆，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果见图3，显示其片段长度约450 bp。DNA测序结果表明PCR扩增到的ITS rDNA序列长度为434 bp。该序列提交GenBank并进行BLAST分析，结果显示A10-2与Wickerhamiella versatilis相似性为100%。综合形态学观察、生理生化测试和分子生物学鉴定，初步确定A10-2为W.versatilis。
5、W.versatilis A10-2耐盐性分析
如图4所示，NaCl质量分数对A10-2生长曲线影响显著，当NaCl质量分数为5%时，最适宜A10-2生长，NaCl质量分数为18%时，生长延迟期明显延长，延迟期达到30 h。说明A10-2具有一定的耐盐性，可以在高盐（18% NaCl）环境中生长，但细胞增殖速率受到一定程度的抑制。
6、W.versatilis A10-2菌株4-EG合成代谢途径分析
已有文献表明，酵母类微生物可以利用阿魏酸作为前体物质代谢合成4-EG，主要中间代谢产物为4-VG。因此，本研究将阿魏酸、4-VG作为底物分别添加发酵培养基，接种W.versatilis A10-2进行发酵，以分析菌株的4-EG合成代谢途径，结果如图5所示。添加阿魏酸或者4-VG后，发酵液中均检出了大量的4-EG；其中阿魏酸组同时检出了4-VG（图5a），4-VG组检出的4-VG相对峰面积较对照组下降了89.4%（图5b，表3）。表明W.versatilis A10-2主要以阿魏酸为底物，在阿魏酸脱羧酶的作用下脱去羧基得到中间产物4-VG，进一步通过4-VG还原酶催化得到4-EG。
7、W.versatilis A10-2在酱油中的应用
添加W.versatilis A10-2种子培养液到酱油发酵液中，其理化指标测定结果如表4所示，实验组氨基酸态氮与对照组（未接种A10-2）相近，总酸较对照组有一定幅度提升，而还原糖、pH值有一定幅度降低，推测主要原因是还原糖被W.versatilis A10-2代谢利用，并产生了一定量的酸性物质。上述结果表明，W.versatilis A10-2应用于酱油发酵液，对氨基酸态氮影响不显著，可轻微提高总酸含量，并降低还原糖含量。
为了验证W.versatilis A10-2在酱油发酵液中4-EG的代谢能力，采用GC-MS对上述发酵液进行了4-EG定量分析，结果如表5所示。发酵12 d，4-EG质量浓度为0.63 mg/mL，添加阿魏酸后4-EG含量质量浓度进一步提高为12.05 mg/mL（表5），对照组（未接种A10-2）未检出4-EG。这一结果证实W.versatilis A10-2可在酱油发酵液中合成4-EG，添加阿魏酸可以显著提高4-EG含量，因此认为其具有优化提高酱油发酵液4-EG含量的应用潜力。
如图6所示，香气鉴评表明，将添加W.versatilis A10-2得到的高4-EG含量酱油发酵液调配到成品酱油中，香气方面，可以一定程度上提升成品酱油酱香、醇香和焦香；口感方面，可一定程度缓和咸味，同时能够提升鉴评人员的偏好程度。说明其在酱油风味和口感改善的方面有较大的应用前景，对于迎合消费者需求具有重要意义。
结 论
EG是酱油中关键风味物质，也是典型酱香味的特征风味物质之一，一定浓度的4-EG对酱油的风味起到至关重要的作用。本研究从酱油发酵醪中分离得到1 株产4-EG的酵母菌株A10-2。采用微生物常规鉴定手段和分子生物学方法研究A10-2的种属关系，初步鉴定其为W.versatilis。W.versatilis A10-2可以耐受18% NaCl，能利用阿魏酸合成4-VG，并可将4-VG还原为4-EG。在酱油发酵液中添加阿魏酸时，W.versatilis A10-2可以将4-EG质量浓度提高到对照组的19.1 倍。在成品酱油中添加高4-EG含量酱油发酵液，可显著改善酱油酱香和醇香。上述结果显示出W.versatilis A10-2在提升酱油4-EG含量、改善酱油香气方面的巨大潜力。在大罐酱油发酵风味普遍偏弱的情况下，生物强化4-EG含量对于提升酱油品质有重要意义；因此，调控W.versatilis A10-2在酱油发酵醪中的生长和代谢，稳定实现酱油风味改良是下一步的研究重点。
本文《产4-乙基愈创木酚酵母的鉴定及其在酱油中的应用》来源于《食品科学》2021年42卷12期138-144页，作者：邹谋勇，何理琴，孙启星，朱新贵。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200317-259。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网
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