近日，中北大学张志军教授和华南理工大学于淑娟教授团队在Critical Reviews in Food Science and Nutrition发表题目为《Sensory evaluation, chemical structures, and threshold concentrations of bitter-tasting compounds in common foodstuffs derived from plants and Maillard reaction: A review》的综述，该文呈现了来自于植物以及美拉德反应的食品基质中苦味物质的分离、感官评价及结构鉴定的方法。第一作者为中北大学化学工程与技术学院李河博士，通讯作者为中北大学张志军教授和华南理工大学于淑娟教授。论文得到了国家自然基金（31771931和32001817）、山西省高校创新计划（2020L0298）及中北大学博士科研启动基金等项目资助。

Introduction

味觉是影响食品选择性的主要因素之一，食品中的苦味物质会严重影响食品的可接受度。一般人们喜欢甜、咸和鲜味，而拒绝苦味。按照大多数人的认知，甜味、咸味和咸味分别对应富含碳水化合物、矿物质和氨基酸或蛋白质的食品。部分仪器检测和人类感评表明，物质的味觉和香味与化合物的分子机制有关系。然而，随着分离科学的进步，化合物的味觉和结构类型之间并没有明确的关系。一些富含大量碳水化合物的食物并没有甜味，而有甜味的食品只有很少的碳水化合物。类似地，有明显鲜味的西红柿和蘑菇只有少量的蛋白质。此外，不同的氨基酸表现出甜、苦、酸、咸等不同味觉。越来越多有关化合物味觉的研究和可用的数据逐渐揭开了苦味物质的面纱，并且多数苦味物质对人体有益。比如啤酒咖啡中的苦味因给予食品独特的风味而受大众喜爱；西兰花中苦味的异硫氰酸酯具有抗癌活性。

苦味化合物有各种天然或人为的来源。如莲子、芥菜、葡萄酒、啤酒和茶中的化合物天然来源于植物，而面包和酱油等食物中的苦味化合物则在加工和发酵过程中产生。尽管当前已有大量关于苦味物质的报道，但化合物结构与味觉之间的关系仍不明确。这篇综述系统阐述了食品基质中苦味化合物分离、感官评价方法、结构鉴定及苦味阈值等信息。总的来看，这篇综述中的数据有利于研究有效的苦味掩蔽策略，提高苦味化合物结构与苦味感知的理解，确保食品产品的可接受度。

Identification and sensory evaluation of bitter compounds

由于化合物结构的多样性和食品基质复杂性，不同食品中味觉化合物的鉴定一直被认为是个巨大的挑战。为了明确味觉化合物的结构，首先要从食品基质中分离得到较高纯度的化合物单体，这就涉及到了分离、收集、浓缩、纯化及冻干等一系列流程。紧接着，需要利用感官评价方法对这些化合物的味觉特性进行确定。最后，利用高分辨质谱及核磁共振等手段对化合物进行结构鉴定，明确其结构式及构象等信息。

Isolation and identification of bitter compounds

得益于分离科学的进步，复杂食品基质中化合物的分离有多种方法，包括连续溶剂萃取（CSE）、液液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）、多级超滤（MS-UF）、迭代色谱、凝胶渗透/吸附/过滤色谱（GPC/GAC/GFC）、一维/二维半制备液相色谱（SP-HPLC）以及高速逆流色谱（HSCLC）等。CSE和LLE是利用不同极性的溶剂对样品进行萃取以得到具有不同极性馏分的方法。这两种方法易于操作且不需要复杂的设备，但得到的馏分仍旧是混合物，且成分相对复杂，难以定性。CSE和LLE往往结合色谱技术（如GPC, GAC, GFC, SP-HPLC和 HSCLC）使用，以进一步纯化分离得到较纯净的单体化化合物。一般来说，根据食品基质的差异，上述方法会以不同的组合结合使用。

对于化合物的鉴定，当前最常用也最有效的方法是质谱和核磁共振光谱。通过比较不同化合物的质谱碎片结构、化学位移结果以及与相应的标准品保留时间、碎片离子相比较，往往可以快速确定其结构。对于一些结构很难确定或无法取得标准品的物质，还需要化学合成的方法来辅助定性。

Evaluation of bitter taste

过去三十年来，有鉴于分析化学、电化学、分析生物学、电生理学及计算机模拟科学的发展，人类感官评价物质苦味特性及理解其机制已经实现。基于聚合物和半导体等人造味觉传感器的发展也进一步加深了对苦味特性机制的阐释。特别是电子舌的应用，极大提高了对具有几种味觉特性的化合物的评价效率。

Sensory evaluation by humans

当前，利用人的味觉去感知化合物苦味仍旧是最常用的方式，最常用的方法主要是阈值测试和标度法。这两种方法分别可以得到识别阈值和检测阈值。对于阈值测试，一般是采用对化合物进行稀释的方法进行测定，以浓度稀释到评价人无法感知作为最小阈值，以所有评价人得到最小阈值的均值作为化合物的最小阈值。标度法则是采用一种广为人知的化合物作为参照，待测化合物与之比较进行测定，如多数研究中，采用0.03, 0.08和0.15 wt.% 的咖啡因溶液作为参考，其对应的苦味强度分别为2，5和10。标度法面临一些问题，如评价者会潜意识地避开最大或者最小范围，使得得分结果都在中间范围，因而不能准确反应样品的实际苦味特性。

因此阈值测定法成为人评价物质苦味较常用的方法，由德国慕尼黑大学Peter Schieberle 和Hofmann团队提出的感官稀释分析法（Taste dilution analysis，TDA）、半舌法（half-tongue test，HTT）以及以它们为基础发展的，感官评价结合仪器分析的分子感官组学（molecular sensory science，MSS）便是基于阈值测试发展起来的方法。典型的基于感官评价和仪器分离的图见图1。

图1. 典型的制备液相（A）与味觉稀释因子（B）图

感官评价者不能随意选取，需要提前进行训练，按照国际标准，感官评价实验室需要对检查区、样品制备区、办公室等进行特定的划分，温度、湿度、气味、噪声、装饰以及光线都需要严格控制。如在评价红酒味觉特性时，要带上鼻夹，以防止挥发性香味产生干扰，从而影响苦味的判断。特别需要注意的是，感官结果易收到评价者基因型、生理及心理因素的影响。如丙基硫氧嘧啶溶液被一些人感知为苦味，但有些人却感知不到。

虽然利用人的味觉去感知化合物苦味几乎可以测定所有基质，但对于毒性不明的物质，这种方法就受到限制，另外，这些方法不适用于高通量以及快速感知。

Evaluation using sensor detection technology

随着传感器技术的发展，感官评价可以电子传感器实现，这些传感器可以模拟苦味受体细胞在体外接触到苦味物质的反应，利用不同方式将生理信号转化成电子信号，从而感知苦味。

细胞和纳米检测器

在人类口腔细胞中表达的的苦味受体（bitter taste receptors，TAS2Rs）G蛋白受体一族，它们可以被大量苦味配体激活。当TAS2Rs遇到苦味化合物，TAS2Rs-gustducin-phospholipase C-IP3通道被激发，使内质网释放钙离子，钙离子浓度升高打开了瞬时受体电位离子通道蛋白，使细胞发生去极化，释放神经递质，从而将刺激传递给大脑。人体的苦味传导机制见图2。

图2. 人体细胞苦味传导机制图

基于这一苦味传导机制，人类在体外将苦味受体TAS2Rs和α质粒 DNA 共转染，即得到了可识别特定苦味物质的细胞，利用荧光染料对细胞内钙离子染色后，通过测定荧光变化，确定钙离子浓度，从确定苦味化合物的浓度。然而，由于一个苦味受体只能特定识别一部分苦味物质，因此细胞检测器具有交叉的选择性，只适合对单一化合物进行识别。例如hTAS2R39对表儿茶素没食子酸酯（ECG）由很强的响应，但hTAS2R16和hTAS2R38却对儿茶素类物质没有任何响应。如果想利用细胞检测器实现对所有苦味物质的识别，则需要把所有的受体都共转染到细胞上。但这样会严重降低转染效率，影响荧光强度的测定。因此，在此基础上，人们提出了纳米检测器。

纳米检测器原理与细胞检测器相同。它是将一些先进的纳米材料引入检测装置，从而提高灵敏度和选择性的方法。这些材料包括单壁碳纳米管场效应晶体管、羧基聚吡咯纳米管场效应晶体管以及石英晶体微天平等材料。细胞和纳米检测器由于花费高、需要较高的构建技术等限制，在食品中的应用并不广泛。

电子舌

自1909年，电子舌的第一代雏形被提出，它被应用到了各个领域。电子舌使用数字工具和/或化学计量学，包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘（PLS）分析和各种人工神经网络，提供构成调查样本特征“指纹”的化学图像，其机理示意图见图3。

图3. 模拟人体感知系统的电子舌机理图

Sensory evaluation by animals

利用动物进行感官评价主要有两种方式：一种是不需要手术的行为分析，另一种是需要手术的电生理测试。其中行为分析又分为简短摄取法和双瓶法。每种方法的具体原理及操作见原文。

利用动物替代人类进行苦味检测可在感官分析的基础上进一步扩大检测范围，对一些毒性未知的物质也可进行苦味检测。但动物的行为分析法会受到动物自身条件的影响导致准确度低，电生理学实验由于要对实验动物进行手术，实验难度大，在食品领域的应用不多。

Bitter-tasting compounds in food

为了促进苦味物质化学特征的研究，2012年建立了苦味库（Bitter DB; http://bitterdb.agri.huji.ac.il）。该库包含了苦味物质的分子和受体信息，并于2019年进行了更新，所包含的苦味物质从550种上升到1000种。然而并没有关于食品中苦味物质的数据库，本文表1和表2呈现了食品中常见苦味化合物的结构式、苦味阈值、来源等信息，具体见正文。

食品中的苦味化合物主要包括生物碱、多酚、无机盐、氨基酸及多肽、皂苷类、脂肪酸及其氧化产物等。具有苦味的常见食品包括咖啡、可可、啤酒、红酒、胡萝卜、芦笋、榛子、燕麦、花椒、爆米花、土豆、橄榄油、黄酒，甜菜根、全麦面包、焦糖色素等。不同可谓化合物的苦味阈值在4-85000μmol/L之间，具体见正文表1。图4为苦味化合物在食品中的分布。

图4. 苦味物质在常见食品中的分布

Potential pathways of bitter compounds

基于这些化合物的结构及食品基质的形成，他们主要来源于植物生成代谢、发酵及热加工处理中。例如，大部分的多酚、黄酮、生物碱、皂苷、氨基酸等都属于植物代谢产物，产生于植物生长发育及自我防御过程中；酪醇和色醇主要是酪氨酸和色氨酸的发酵产物；脂肪酸氧化产物及美拉德反应产物则主要来自于热加工处理过程。特别地，美拉德反应被提出是苦味物质生成的主要途径之一。图5是烤全麦面包和焦糖色素中美拉德反应生成苦味物质的路径。

图5. 烤全麦面包（A）和焦糖色素（B）中美拉德反应作为主要途径生成苦味物质的路径

Conclusions and perspectives

这篇综述主要呈现了来自于植物以及美拉德反应的食品基质中苦味物质的分离、感官评价及结构鉴定的方法。感官评价可以通过人、动物、细胞以及仪器分析实现。然而最常用也最经济的方法利用人和仪器分析结合来进行感官评价的方法。迄今为止，食品与饮料中的许多苦味物质已经被分离出来，如咖啡、红酒、烤面包和酱油等。它们的苦味阈值差异很大，（高达10 6 倍），这意味着，很难清楚地建立苦味物质结构与阈值浓度的关系。然而，很明显，化合物的结构特征与食品组成在苦味测定中扮演着关键的角色。目前关于苦味未知的研究还不是很详尽，未来研究需要建立化学结构、食品组成与苦味强度的关系。

当前用来评价食品中纯度较高的单一化合物味觉特征的方法很可能受到化合物结构的影响，尤其是分子量较大的化合物。因此，标准的前处理、纯化以及感官评价方法还需要进一步进行优化。

当前化合物苦味以及苦味阈值的预测模型建立仍旧基于化学结构，考虑到化合物结构与苦味特征的关系并不明确，这种模型并不能推广接受。为了建立结构（化合物的分子量、杂环取代基类型、键合类型）-味觉特征的关系，一个扩大的综合的苦味数据库及化学计量数据库是必要的，因此可用的苦味数据库（Bitter DB）是很有用的。然而，它需要进一步的扩大。此外，化合物上一些基团的位点和分布对苦味的影响也要考虑到。由于化学结构分析困难，当前这一影响被大多数研究者忽略。最后，化合物上一些特殊基团的部分降解或可控降解，结合改进的感官评价、结构鉴定及计算机模拟技术来建立结构-味觉特性的关系很有必要。

在现代社会中，由于植物多酚的健康益处和化学预防等优点，它们在现代社会被作为保健营养品，但它们中的大多数是苦的。考虑到苦味显著影响含有这些物质食品的可接受度，特别是红酒和饮料，我们应当研究一些不影响多酚生物活性的有效苦味掩蔽剂或包埋剂，如甜味剂、环糊精、磷酯类、阿魏酸、乳酸锌等。

第一作者简介

李河 博士

中北大学化学工程与技术学院

李河，男，工学博士，现为中北大学化学工程与技术学院讲师，校聘副教授。

研究兴趣：食品美拉德反应中苦异味及有害物质的生成机制；天然植物多酚抑制有害产物的结构效应及构效关系；食品接触材料中潜在危害物的检测与迁移。

目前主持国家自然基金青年项目1项，山西省高校创新计划1项，晋中市重点研发计划1项，参与国家自然科学基金面上项目、中央引导地方项目、山西省农业农村“六新”项目等多项，在国内外期刊公开发表学术论文30余篇，其中SCI收录22篇，第一或共一作者论文15篇，其中SCI收录13篇，授权国家发明专利1件，是国内外多个期刊审稿人。

通讯作者简介

张志军 教授

中北大学生物工程学科系主任

张志军，男，教授，博士生导师、浙江大学博士，现任中北大学生物工程学科带头人、系主任，中北大学晋中产业技术创新研究院院长，兼任山西省生物工程学会常务理事（生物功能成分提取与利用分委员会主任），入选2018年度山西省“三晋英才”支持计划拔尖骨干人才、晋中市第三批“551计划”创新类人才。先后主持国家863子项目以及农业部948子项目，山西省国际合作、科技攻关、留学基金等省部级项目12项，现已审定紫苏新品种2个，研发出紫苏油、蛋白、茎叶三大系列产品13个，授权国家发明专利6项，实用新型专利1项，化工出版社出版《紫苏研究与产品开发》专著1部，发表学术论文50多篇，曾获山西省科技进步奖各1项。

于淑娟 教授

华南理工大学食品科学与工程学院

于淑娟，女，华南理工大学食品科学与工程学院二级教授，博士生导师，广东省国际糖业中心主任，中国制糖行业专家组成员和标准化委员会成员，SIT会员。《现代食品科技》副主编（EI收录）、《中国甜菜糖业》副主任编委、《华南理工大学学报自然科学版》（EI收录）、《甘蔗糖业》、《食品工程学报》、《食品工业科技》、《农产品加工》等8家杂志社的编委。近年来主要研究功能性碳水化合物及其衍生物衍生过程的食品化学理论、工程新技术、新产品；新型食品添加剂及其在食品中的功能性和安全性等。近五年主持国家自然科学基金面上项目3项，国家自然科学基金重点项目子课题1项，科技部“十二五”科技支撑计划项目1项，科技部农转资金项目1项，国际合作科技攻关项目2项，企业委托项目6项，实到科研经费700多万元。省部级鉴定成果2项。发表文章100多篇。

编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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