血栓性疾病包括动脉粥样硬化、动脉血栓形成和深静脉血栓形成，越来越多的患者受此类疾病的困扰。止血作为有效的生理防御机制能够保证血液在循环中正常流动，而止血障碍会加速血栓的形成。除了血小板和凝血因子，凝血酶的激活和抑制在止血中也发挥了关键性作用。凝血酶是一种损伤处血管内皮细胞产生的多功能蛋白酶，它参与凝血过程中各个关键性环节，主要将纤维蛋白原转化成纤维蛋白，并与后者交联形成血栓。目前，抗凝血研究通常围绕内源性抗凝血途径（活化时间凝血酶时间（APTT））、外源性抗凝血途径（凝血酶原时间（PT））、共同抗凝血途径（凝血酶时间（TT））以及降低纤维蛋白原（FIB）开展。
目前常用的抗凝血药物可能会带来出血等健康风险。因此，寻找安全有效的抗凝血成分一直是人们关注的焦点。最新的研究表明大蒜苗能够通过改变APTT、PT、TT、FIB含量而发挥抗凝血作用，揭示了葱属抗凝血活性的潜能。沈阳农业大学食品学院的周丽丽、朱艳雯、白 冰*等人从大蒜中分离提取大蒜油，通过紫外光谱、分子荧光光谱、动力学分析等探究大蒜油及其主要成分的抗凝血作用，旨在为大蒜油抗凝血功能的研究提供参考。
1、大蒜油气相色谱质-谱联用分析结果
如图1所示，大蒜油分别在6.5、8.5、10.3 min处存在3 个色谱峰，经面积归一化分析，总硫醚含量大于90%。定性分析可以看出，质荷比（m/z）41、73、114、146、178是主要碎片。m/z 114（M a ）、m/z 146（M b ）和m/z 178（M c ）分别为DAS（C 6 H 10 S，114.21）、DADS（C 6 H 10 S 2 ，146.26）和DATS（C 6 H 10 S 3 ，178.33）的分子离子碎片。m/z 41（对应CH 2 ＝CH-CH 2 -）和m/z 73（对应CH 2 ＝CH-CH 2 -S-）是以上3 种物质的共有碎片。
2、大蒜油、DAS、DADS、DATS对凝血酶活性的影响
如图2所示，本研究利用大蒜油、DAS、DADS、DATS与凝血酶进行相互作用后检测凝血酶活性的变化，不同浓度硫化物对凝血酶活性有部分抑制作用，且存在浓度依赖关系，浓度越高，活性抑制越强。进一步以DAS、DADS、DATS与凝血酶作用，1～5 mmol/L浓度范围均对酶活性起到部分抑制效果，其中DATS作用最强，DADS次之，DAS最弱（图2B～D）。
3、酶动力学分析结果
结果如图3所示，经DAS、DADS、DATS处理的凝血酶，V max 和K m 同时发生变化，将直线交点不在横坐标轴上和纵坐标轴上的情况判定为混合型抑制（或共同型抑制），说明该抑制作用属于竞争性和非竞争性的共同型抑制。这意味两种作用方式产生抑制：即与底物竞争酶结合部位方式以及与酶的非活性部位结合形成抑制物-酶复合物的方式，不影响酶与底物的再次结合。
4、荧光分析及分子对接分析结果
如图4A所示，处理后的凝血酶，346 nm波长处处荧光强度降低，且位置和峰形不变，说明大蒜油、DAS、DADS、DATS都能不同程度地与酶发生作用，结合图2分析可知，大蒜油中起到酶活性抑制的物质主要是DADS和DATS，它们单独的作用效果要优于大蒜油和DAS单独作用的效果。如图4B所示，随着DATS浓度增加，346 nm波长处荧光强度逐渐降低，说明DATS与酶蛋白中发色基团相互作用发生荧光猝灭。在本实验条件下，大蒜油、DAS、DADS、DATS本身无荧光。
进一步利用分子对接技术深入探讨DATS对凝血酶三维结构[PDBID：1ETT]相互作用机制。利用三维分子对接技术，DATS与凝血酶的结合能为-4.55 kJ/mol，属自发反应，结合性能良好（图4C）。利用二维分子对接技术，DATS中心位置的硫原子能与酶分子活性位点氨基酸残基Asp189、Gly219和Ala190中的氧原子形成氢键，键长分别为3.06、3.11 Å和2.97 Å，与活性位点氨基酸残基Gly216、Ser195、Trp215形成疏水作用力（图4D），以上氢键及疏水作用力提供了竞争性抑制。DATS与酶分子非活性位点周围的Gly226、Asp221A、Tyr225、Glu217、Cys191、Val213形成疏水作用力（图4D），提供了非竞争性抑制。分子对接结果与动力学结果一致。
5、大鼠体内实验分析结果
凝血四项指标分析结果
如表1所示，与空白组相比，大蒜油、DAS、DADS、DATS处理组的PT、APTT和TT均出现显著增高的趋势，其中DATS组极显著升高（P＜0.01），说明大蒜油、DAS、DADS、DATS均是通过改变内源性（APTT）、外源性（PT）、共同凝血途径（TT）凝血系统而起到抗凝作用；大蒜油、DAS、DADS、DATS组FIB质量浓度极显著下降，分别从（2.13±0.66）g/L降低至（1.48±0.23）、（1.54±0.48）、（1.31±0.35）、（1.16±0.13）g/L，说明大蒜油、DAS、DADS和DATS干预可以降低大鼠血液FIB含量从而发挥抗凝血活性。
抗氧化与抗凝血能力
如图5所示，大蒜油、DAS、DADS、DATS处理组的GSH、GR、TP、T-AOC水平均比空白组略有升高，但都不具有显著性差异（P＞0.05）。这说明大蒜油、DAS、DADS、DATS只有微弱的抗氧化能力，与大蒜油、DAS、DADS、DATS具有显著抗凝血能力的结果并不一致。因此，本实验所揭示的大蒜油、DAS、DADS、DATS抗凝血能力应该与其抗氧化能力无关。
结 论
本研究通过体内和体外实验探索了大蒜油、DAS、DADS、DATS的抗凝血功能，紫外光谱、分子荧光光谱、动力学分析结果表明DAS、DADS、DATS对凝血酶的抑制作用属于竞争性/非竞争的共同抑制效果；二维、三维分子对接分析结果表明抑制属竞争性和非竞争抑制并存的作用方式；大鼠凝血四项的结果从体内的角度印证了大蒜油、DAS、DADS、DATS具有抗凝血功能；大鼠抗氧化实验结果提示大蒜硫醚类抗凝血功能应与抗氧化能力不相关。
本文《大蒜油的抗凝血作用》来源于《食品科学》2021年42卷17期127-132页，作者：周丽丽，朱艳雯，姜晓霞，张旋，檀德宏，刘玲，白冰。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200818-235。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网
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