链霉菌产生的代谢产物具有免疫抑制、抗癌、抗真菌及细菌等多种功能，在植物病害、储粮及饲料防霉、抑制毒素等方面具有广泛应用。调控链霉菌一个重要的机制为碳分解代谢抑制。葡萄糖是一种可被快速利用的碳源，可以起到缩短菌体延滞期和促进菌体生长的作用，碳源较多的培养基可延缓菌丝自溶，有利于合成代谢产物积累，反之，碳源稀薄则会导致菌丝早期自溶。
省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津科技大学食品科学与工程学院的张晓君、路来风、王昌禄*等人以课题组早期从土壤中分离的白黄链霉菌TD-1（Streptomyces alboflavus TD-1）为拮抗菌，研究其在不同浓度葡萄糖培养基中的生长情况及其产生的VOCs对黄曲霉菌生长的影响，并对VOCs组分进行鉴定分析，筛选出一种食品级单体化合物1-辛烯-3-醇，对其拮抗黄曲霉的抑菌机理及抑制黄曲霉毒素合成的调控机制进行研究，旨在为微生物源VOCs在食品中的应用提供参考。
1、葡萄糖浓度对白黄链霉菌生长的影响
白黄链霉菌TD-1在葡萄糖浓度分别为0、5、50、500 mmol/L及N-乙酰-D-葡萄糖胺培养基中生长情况如图1所示。在葡萄糖浓度增加的情况下，TD-1的生物量都呈现增长趋势。在浓度为500 mmol/L时，其湿质量为247.1 mg，干质量为55.6 mg。TD-1在高氏一号改良MM培养基（未添加葡萄糖）生长的菌落直径最大，随着时间的延长其菌落逐渐变大，在10～14 d时直径变化不明显，且菌落开始变黑。随着葡萄糖浓度逐渐增大，菌落直径呈现下降趋势，较无葡萄糖小，第7天以后链霉菌菌斑变厚，浓度为500 mmol/L时，TD-1菌落在发酵后期最厚且无发黑现象，添加N-乙酰-D-葡萄糖胺的效果没有添加葡萄糖效果好。说明添加速效碳源有利于链霉菌生长，且可以减少其自溶现象。
2、葡萄糖浓度对白黄链霉菌产VOCs抑制黄曲霉菌能力的影响
如图2A所示，与CK相比，白黄链霉菌TD-1对黄曲霉的抑制作用极为明显，其菌丝体及孢子较少，对扣过程中其孢子和菌丝体没有掉落在对扣板上，CK掉落在对扣板上的菌丝体和孢子较多。葡萄糖浓度为0、5 mmol/L时，黄曲霉孢子产生的相对较多，菌丝体较少，50、500 mmol/L的孢子较少，菌丝体较多，说明葡萄糖浓度越高白黄链霉菌TD-1产生的VOCs对黄曲霉孢子萌发的抑制作用越强，50、500 mmol/L产生的VOCs抑菌能力较0、5 mmol/L强。
由图2B可知，TD-1在高氏一号改良MM培养基（即葡萄糖浓度为0 mmol/L）培养时，开始产生的挥发性成分较其他浓度高，但总峰面积增幅较小，在第8天时明显减少，葡萄糖浓度为5 mmol/L时产生的挥发性成分相对其他浓度较少，但一直呈现增长趋势；葡萄糖浓度为50 mmol/L时，在0～4 d的挥发性成分产量大幅增加，在第4天达到最高值，但后期明显下降；葡萄糖浓度为500 mmol/L时，0～2 d产挥发性成分少，但在2～4 d挥发性成分增长幅度明显升高，4 d以后产挥发性成分较为稳定，且超过50 mmol/L时VOCs产量为4 种葡萄糖浓度中最高。说明葡萄糖浓度过高在发酵初期有分解代谢阻遏，到后期高浓度的葡萄糖为菌体的生长提供了丰富的碳源和能量来源，延缓了菌体的自溶，为代谢产物的生物合成提供了保障。
3、不同浓度萄糖培养下白黄链霉菌TD-1 VOCs的组分鉴定
由图3可知，共鉴定出60 种主要VOCs，包括酸类、酮类、醇类、醛类、醚类、呋喃类、萜烯类、烷烃类等物质。其中，部分烷烃类物质，包括1,2-环氧庚烷以及二十一烷含量等随着发酵时间的延长、葡萄糖浓度的增加总体降低；醛类物质包括己醛、(Z)-2-庚烯醛、苯甲醛等含量随着发酵时间的延长而降低，然而，随着葡萄糖浓度的增加，部分酮类物质2,3-丁二酮、乙偶姻随着葡萄糖浓度的增加含量逐渐增加；部分醇类物质异丁醇、正己醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇等物质随着发酵时间的延长，含量大体呈现增长趋势，其中1-辛烯-3-醇最为明显；萜烯类物质2-甲基异冰片随着发酵时间的延长含量大体呈现先增加后减少的趋势。
4、1-辛烯-3-醇对黄曲霉产孢能力和生长情况的影响
1-辛烯-3-醇含量梯度为0、5、10、15、20、25 µL/L，对黄曲霉进行抑菌活性测定，结果如表1所示。不同含量1-辛烯-3-醇对黄曲霉生长、产孢抑制率结果如图4所示。在1-辛烯-3-醇含量为5～25 µL/L时，对黄曲霉均具有明显的拮抗作用，生长抑制率在24.94%～100%之间，产孢抑制率在84.50%～100%之间。随着1-辛烯-3-醇含量的增加抑菌活性逐渐增强，15 µL/L时可完全抑制黄曲霉菌的生长及孢子萌发，10 µL/L时其几乎没有孢子，产孢抑制率可达到99.85%，生长抑制率达到75.29%。
5、1-辛烯-3-醇对黄曲霉微观形态的影响
如图5A、B所示，空白组中大部分黄曲霉孢子伸出芽管，孢子形态良好，1-辛烯-3-醇处理组尚无芽管出现并观察到孢子表面有凹陷现象，且孢子数较少，说明1-辛烯-3-醇对黄曲霉孢子有致畸作用，且会抑制黄曲霉孢子的萌发。
如图5C～F所示，预培养2 d黄曲霉菌丝体已经形成孢子囊，生长点较为丰富，且其尖端呈现正常的圆锥形，菌丝体粗细较为均匀、饱满。空白组（处理4 d）的菌丝体形成的孢子囊极多，且有很多成熟的孢子掉落，菌丝体粗细均匀且较为饱满。处理组的菌丝呈现不规则扭曲、干瘪，表面褶皱不平，生长点数量极少，菌丝体较细。说明1-辛烯-3-醇对黄曲霉菌丝体也有明显的致畸作用。
6、1-辛烯-3-醇对黄曲霉线粒体膜电位的影响
1-辛烯-3-醇对黄曲霉线粒体膜电位的影响如图6所示，预培养36 h后，菌丝体呈现出明亮的绿色，说明线粒体膜电位正常；培养48 h及60 h空白组的孢子囊增多且较为为明亮；预培养36 h后暴露于1-辛烯-3-醇12、24 h处理组发生了荧光猝灭现象，荧光强度显著降低。由此可知，1-辛烯-3-醇可显著降低黄曲霉线粒体膜电位，减弱黄曲霉线粒体产ATP的能力。
7、1-辛烯-3-醇对AFB1生物合成的影响
AFB 1 的标准曲线为y=11.028x+9.715 6，R 2 =0.999 9。由图7可知，黄曲霉接种2 d后AFB 1 含量为19.49 μg/kg；培养至第4天AFB 1 迅速升高，含量高达67.79 μg/kg，而经过预培养2 d后暴露在1-辛烯-3-醇中2 d，AFB1含量为21.68 μg/kg，相较于空白组，AFB1含量下降了68.02%，黄曲霉产生AFB1量得到了很好地控制，抑制其合成速率达到31.98%。
结 论
以白黄链霉菌TD-1为拮抗菌，以黄曲霉为指示菌，研究培养基中葡萄糖浓度对白黄链霉菌TD-1生长和VOCs产量等的影响，在发酵初期，500 mmol/L葡萄糖可抑制白黄链霉菌TD-1的生长，但在发酵后期，葡萄糖慢慢被消耗，6 d后阻遏作用被解除，TD-1开始合成次级代谢产物，在发酵后期，有足够而又不过量的葡萄糖，可对白黄链霉菌TD-1的生长以及次级代谢产物的合成起到明显促进作用，生物量及产生的次级代谢产物VOCs含量较高，产量稳定，其产生的抑菌物质可对黄曲霉菌起到很好的抑制作用。此外，从白黄链霉菌TD-1所产生的挥发性物质中筛选出一种食品级挥发物1-辛烯-3-醇，其对黄曲霉生长有较强的抑制作用，可抑制黄曲霉菌的孢子萌发，破坏细胞膜以及线粒体膜完整性，显著降低黄曲霉菌AFB1的产量。以上研究结果可为微生物源VOCs在食品中的应用提供参考。然而，白黄链霉菌TD-1降低AFB1产量是通过抑制黄曲霉生长还是通过1-辛烯-3-醇调控黄曲霉产毒基因还需进一步研究。
本文《Streptomyces alboflavus TD-1产挥发性抑菌物质对黄曲霉菌生长及其毒素的抑制作用》来源于《食品科学》2021年42卷18期51-57页，作者：张晓君，路来风，李淑华，王昵霏，李王强，王安琪，宋冠林，李贞景，王昌禄。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200705-062。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网
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