蜂胶是一类独特的黏合剂和树脂物质，具有多种生物学活性。黄酮类与酚酸类化合物在其中大量存在，使其具备丰富的营养价值，然而目前只对少部分蜂胶活性成分进行过研究。咖啡酸β-苯乙醇酯（CAPE）在蜂胶生物活性成分中占重要地位，具有免疫调节、抗癌、抗微生物、抗炎和抗氧化等一系列的生物活性，尤其在抗癌方面表现出很大的潜力。目前已有研究者利用化学方法合成了CAPE，解决了从蜂胶中提取时提取率低的问题。
人血清蛋白（HSA）是人血浆中浓度最高的载体蛋白，能和各种内源性与外源性的分子进行结合并递送，成为了当前研究最为普遍的蛋白之一。目前，CAPE参与人体循环系统药代动力学过程的详细转运机制尚不清楚，CAPE与HSA生理条件下结合作用已有报道，但不同pH值对CAPE与HSA结合作用的影响鲜有报道。渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心的范金波、邢 莉、励建荣*等人拟通过荧光发射光谱探究pH值对CAPE与HSA结合行为的影响，通过同步荧光光谱分析CAPE结合对蛋白结构的影响，通过位点Marker实验确定两者的结合位点，实验结果为CAPE活性稳态化保持、靶向递送提供理论支撑。
1、CAPE对HSA荧光强度的影响
如图1所示，在298 K时，3 种pH值条件下CAPE对HSA均产生荧光猝灭现象，随着CAPE浓度的增加（0～14.4 μmol/L）荧光强度呈规律性的减弱，峰形无显著变化。在pH 3.0时，HSA的荧光强度峰值降低了43%；pH 5.0时，HSA的荧光强度峰值降低了40%；pH 7.4时，HSA的荧光强度峰值降低了78%。不同pH值条件下，最大发射波长（λmax）出现不同的变化趋势，pH 3.0时发生微弱蓝移（327～326 nm），pH 5.0时发生微弱红移（338～339 nm），pH 7.4时发生红移（339～343 nm），可能是由于pH值和CAPE对HSA共同作用使荧光发色团附近的微环境发生了变化，红移使极性增强。由图1D所示，猝灭率随着CAPE浓度的增大而增大，其中pH 7.4时的猝灭率明显高于pH 3.0和pH 5.0，差异显著（P＜0.05）；而pH 3.0和pH 5.0相比，差异不显著（P＞0.05）。
如图2所示，310 K时，在3 种pH值条件下CAPE对HSA均产生荧光猝灭现象，且峰形未发生明显变化。当pH 3.0、5.0和7.4时，HSA的荧光强度峰值分别降低了43%、62%和81%。pH值变化影响了λmax，pH 3.0、5.0和7.4时，随着CAPE浓度的增加λmax分别红移6 nm（325～331 nm）、红移8 nm（336～344 nm）和红移3 nm（337～340 nm）。这表示CAPE与HSA发生了相互作用，加之pH值的影响改变HSA的结构，使荧光基团附近的微环境产生变化，极性增强。由图2D可知，相同CAPE浓度下，猝灭率随着pH值的升高而增大，pH 7.4时最高，pH 3.0时最低，说明pH值影响了CAPE与HSA的结合作用。
2、荧光猝灭机理和结合常数
HSA与小分子之间的荧光猝灭类型主要分为静态和动态。静态猝灭的过程是猝灭分子和HSA在基态形成了不发光的物质；动态猝灭是HSA的激发态分子和猝灭分子发生了碰撞，返回到基态，2 种方式均可以使HSA的荧光强度降低。静态猝灭的猝灭常数Ksv和温度呈反比，动态猝灭呈正比。本实验采用Stern-Volmer方程（1）和Acharya方程（2）分析荧光猝灭机理。
3、热力学性质和作用力类型
小分子和HSA之间主要基于氢键、范德华力、疏水相互作用和静电相互作用4 种作用力结合。在298 K和310 K温度下通过Van’t Hoff方程（3）和热力学方程（4）计算热力学参数：
4、同步荧光光谱测定
如图3所示（点击下方阅读原文即可查看图3），298 K温度下，无论Δλ=15 nm还是Δλ=60 nm，CAPE的参与对HSA都存在猝灭作用，而且随CAPE浓度逐步升高，HSA荧光强度逐渐降低。当Δλ=15 nm时，pH 3.0与pH 7.4条件下，对应的酪氨酸残基的吸收峰微弱蓝移1 nm和2 nm，pH 5.0时未发生位移；当Δλ=60 nm时，pH 5.0和pH 7.4条件下，色氨酸残基的吸收峰蓝移1 nm和6 nm，pH 5.0时未发生位移。且伴随pH值的增大，色氨酸最大吸收峰的降低趋势更加明显。表明CAPE的加入，加之pH值的影响，使色氨酸附近微环境的疏水性增强，极性减弱。
如图4所示（点击下方阅读原文即可查看图4），310 K温度下，伴随CAPE浓度的升高，酪氨酸与色氨酸残基内源荧光强度均呈现规律性地降低，与图3呈现出相似的规律。当Δλ为15 nm时，pH 5.0和pH 7.4条件下，对应酪氨酸残基的吸收峰微弱蓝移1 nm和2 nm，pH 3.0时未发生位移；当Δλ为60 nm时，pH 3.0和pH 7.4条件下，色氨酸残基的吸收峰蓝移1 nm和3 nm，pH 5.0时红移1 nm。由此能够推测，2 种氨基酸残基附近的微环境均产生了微弱的变化。且色氨酸最大吸收峰的降低趋势随pH值的增大更为明显，pH 7.4时最明显。
综上所述，HSA中的酪氨酸残基与色氨酸残基比较，后者的荧光强度减弱的更显著。说明色氨酸残基可能比酪氨酸残基更接近于结合位点，CAPE的加入和pH值的共同影响改变了HSA的构象。
5、CAPE与HSA结合位点的分析
由图5可以得出，二者的存在均显著降低了CAPE与HSA的结合，华法林存在时产生的荧光猝灭变化比布洛芬更显著。结果说明CAPE与HSA的结合位点位于亚结构域IIA和IIIA之间，更接近于Sudlow’s site I。
结 论
本实验采用荧光光谱法研究CAPE与HSA在pH 3.0、5.0、7.4条件下的结合作用，经过分析计算出猝灭常数、猝灭类型、结合常数、作用力类型，再通过同步荧光探究3 种pH值条件下CAPE对HSA构象的影响，最后位点Marker实验确定结合位点。结果表明3 种pH值条件下CAPE对HSA均产生了荧光猝灭现象，类型为静态猝灭，pH 7.4时具有最强的猝灭作用，同时结合常数最大，说明生理条件下CAPE与HSA更容易结合；热力学参数表明CAPE与HSA主要通过范德华力和氢键作用结合；同步荧光表明CAPE和pH值的共同影响改变了HSA的构象；位点Marker实验表明，CAPE与HSA的结合位点位于Sudlow’s site I附近。实验结果证明，pH值的增加促进了CAPE与HSA的结合，这对于探究蜂胶生物活性成分在体内的转运，以及为蛋白基-CAPE载体的开发提供了理论依据。
本文《荧光光谱法探究pH值对咖啡酸β-苯乙醇酯与人血清蛋白相互作用的影响》来源于《食品科学》2021年42卷22期31-37页，作者：范金波，邢莉，李孟雨，麻奥，吕长鑫，励建荣。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201109-076。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网
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