助力基因编辑实验增光添彩

基因编辑，指的是利用各种分子生物学的方法对细胞或者生物体的基因组 DNA 序列进行永久性的改变。

早期的基因编辑方法，例如使用锌指核酸酶（ZFN）或者转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）的方法，因为需要针对具体目标位点对蛋白酶本身进行定制改造 [1]，因此相对昂贵且耗时较长。与早期的方法相比，CRISPR 介导的基因编辑方法只需要根据具体的目标位点对引导 RNA 进行定制 [1]，因此其在使用灵活性方面得到了极大提升。CRISPR 技术一经问世就得到了全世界科研人员的广泛关注。

CRISPR 介导的基因编辑实际上是基于细菌或者古细菌本身所具有的一类天然免疫过程所开发出来的技术。CRISPR 系统在基因组上的元件，我们一般称之为 CRISPR 序列，于 1987 年首次在大肠杆菌中发现 [2]；在 2003 年，CRISPR 系统的功能首次被人们发现与微生物的获得性免疫相关联 [3]：CRISPR 系统可以识别并切割与之互补的 DNA 序列，从而让细菌记住并摧毁病毒入侵者 [3]。2013 年，研究人员首次证明了 CRISPR 介导的基因编辑方法可以被应用于哺乳动物细胞当中 [3]。在这之后，得益于其在基础科研和转化医学领域里的广泛用途，CRISPR 技术本身在有效性、特异性和灵活性等方面得到了迅猛发展，为功能基因组学的研究人员解析物种基因组提供了强有力的工具。

CRISPR 基因编辑需要两个关键组分：Cas 核酸酶和引导 RNA，这两个组分结合形成核糖核蛋白（RNP）复合物。

在进入细胞后，引导 RNA 可与基因组上的目标位点相结合，并引导 Cas 蛋白酶在特定的基因组位点上进行切割，形成双链 DNA 断裂（DSB） [1,3,4]。以实验中最为常见的 SpCas9 系统为例（Fig 1），在天然情况下其引导 RNA 分子有 2 个，一个是决定靶点序列特异性的 crRNA， 其 5’ 端的 20 个碱基负责与基因组的目标位置结合，而其 3’ 端的保守序列则与另一个 CRISPR RNA 分子 tracr RNA 进行结合，形成 RNA 复合体，这一复合体可以帮助 Cas9 核酸内切酶定位到基因组上的目标区域，产生双链断裂 [1,3,4]。CRISPR 切割时，对目标靶点的序列也有一定的要求，对于 SpCas9 来说，就要求在 20 个碱基的目标靶点的 3’ 端必须是 3 个碱基的 NGG，这个特殊的 motif 我们称之为 PAM（前间区序列邻近位点） [1,3,4]。

Fig 1：CRISPR Cas9 RNP 复合体 [5]

RNP 进入细胞核后，会在基因组的目标位点产生双链 DNA 断裂，在这之后，则会根据在细胞核内是否同时存在修复模板，可能会出现两种结果：

1）在没有修复模板存在的情况下，细胞倾向于使用非同源末端连接（NHEJ）的修复方式，从而在断裂位置随机的引入碱基的插入或者缺失（InDel），如果这类突变发生在基因的编码区域，则会大概率的引发移码突变，这也是我们可以通过 CRISPR 技术进行基因敲除的原因 [5]；

2） 第二种情况，如果在断裂产生的同时在细胞核中存在有与目标区域的序列具有同源性的外源修复模板，则会小概率的引发另一种被称为同源介导重组（HDR）的修复通路，这也是我们可以用 CRISPR 进行基因敲入的理论基础 [6,7]。

Fig 2: 创新驱动的 IDT 埃德特的 Alt-R CRISPR 基因编辑整体解决方案

图源：IDT 埃德特

Integrated DNA Technologies, Inc. （IDT）埃德特长期深耕基因编辑领域，目前可以提供包括通过化学合成的高度定制化的引导 RNA（gRNA）序列，各类独具特色的 CRISPR 核酸酶，配套使用的电转/HDR 基因插入增强子，各类对照试剂以及针对基因敲除/插入应用开发的序列设计工具，实现了从实验设计到结果分析的全流程覆盖（Fig 2），让高效精准的基因编辑实验不再困难。

在基因编辑实验中，经常需要对 CRISPR 实验所需的关键试剂组分（gRNA 或者 CRISPR 蛋白酶）是否有效递送进入细胞予以验证。在活细胞中实现 Cas 蛋白酶的可视化是验证递送效率的有效手段之一，而使蛋白可视化的最常见手段则是将其与荧光蛋白（如 GFP 或者 RFP）进行融合。近期，IDT 埃德特发布了一系列带有荧光标记的 Cas9 蛋白酶，这些蛋白经过精心优化，在保持目标位点的高效切割活性的同时，可以在活细胞中实现转染后的蛋白可视化。各类带有荧光标记的 CRISPR 试剂组分结合流式分选的方法，可以对递送后的细胞进行富集从而实现比未标记的 CRISPR 组分更高的编辑水平。该系列带有 GFP/RFP 荧光标记的 Cas9 蛋白酶，是从大肠杆菌菌株中纯化的重组化脓性链球菌 Cas9 核酸酶，其上带有核定位信号（NLS）和 C 端 6-His 标签。和常规的 Cas9 蛋白酶一样，该系列荧光蛋白酶同样以 10 µg/µL 的溶液形式提供。100 µg 荧光 Cas9 核酸酶 = 530 pmol [8]。

Fig 3: IDT 埃德特提供的荧光标记 CRISPR 蛋白在目标靶点稳定实现高效切割 [9]

针对人源 HPRT 基因设计多条引导 RNA 序列，化学合成的 Alt-R CRISPR-Cas9 sgRNA 与 Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3，或融合有荧光标记的 Cas9-GFP/RFP 在体外结合形成核糖核蛋白复合体（RNP）。RNP 通过 Lonza 96 well shuttle nucleofector 电转系统电转进入 HEK293 细胞；在电转后 48 小时，提取细胞基因组 DNA，并通过 T7EI 错配酶法对目标位点的切割效率进行量化（N=3）。

Fig 4: 荧光标记的 Cas9 蛋白可用于流式细胞术介导的、编辑后细胞富集 [9]

（A）靶向人 HPRT 基因的 CRISPR-Cas9 sgRNA 和 Cas9-V3 或者 GFP 标记的 Cas9 蛋白在体外形成 RNP; 随后 RNP 通过脂质体转染或者电转的方法（Lonza Nucleofector system，2 µM RNP）递送至 HEK293 细胞中。通过流式细胞术对带有 GFP 阳性信号的细胞进行计数。

（B）设计 Alt-R CRISPR Cas9 sgRNA 用以靶向多个人源基因，sgRNA 与 Alt-R Cas9 V3 或者 Cas9-GFP 结合形成 RNP 复合体，随后 RNP 通过脂质体转染的方法递送进入 HEK293 细胞中。转染 18 小时后，通过流式细胞术按照 GFP 强度将细胞分成三个亚群，分别为 GFP High（前 20%）, GFP Medium（60-80%）和 GFP Low（后 60%）。随后将这些细胞亚群重新铺板并在 48-72 小时后收集其基因组 DNA，并通过 NGS 二代测序的方法对细胞内编辑发生的比例进行量化。

（C）电转 18 小时后 HEK293 细胞内可以观察到 GFP 信号 [6]。

Fig 5: IDT 埃德特提供丰富种类的荧光标记 CRISPR 试剂产品，这些产品包括带有 ATTO 标记的 tracrRNA 和 GFP/RFP 融合的 Cas 蛋白酶 [10]

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关于 IDT 埃德特

Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) 埃德特是丹纳赫集团（Danaher Corporation，纽约证交所代码：DHR）生命科学平台旗下的一家运营公司。IDT 致力于面向生命科学界开发、生产并销售核酸产品，为学术与商业研究、农业、医疗诊断和药物开发等领域提供支持。IDT 开发了多项针对基因组应用的专利技术，涵盖二代测序、CRISPR 基因组编辑、合成生物学、数字 PCR 以及 RNA 干扰。通过 GMP 服务，IDT 生产的产品被科学家用于研究多种形式的癌症以及各类遗传性和传染性疾病。作为定制核酸生产领域的优秀厂商，IDT 为超过 130,000 名生命科学研究人员提供服务。IDT 创立于 1987 年，其生产总部位于美国爱荷华州科勒尔维尔，并在美国加利福尼亚州圣地亚哥、美国北卡罗来纳州三角研究园、比利时鲁汶以及新加坡等地设有生产工厂。

内容审核：潘成、杨柠曳

题图来源：站酷海洛

图片来源：参考文献

参考文献:

1. The CRISPR Basics Handbook https://go.idtdna.com/Download-CRISPR-Handbook.html?web_source=sitefinity&web_medium=website&web_campaign=00323_1d_03&web_content=prod-cas9&promo_name=CRISPR%20Basics%20Handbook&promo_id=00323_1d_03&promo_creative=Sidebar%20Banner&promo_position=1

2. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol. 1987 Dec; 169(12): 5429–5433.

3. The Heroes of CRISPR. Cell 164(1):18-28.

4. CRISPR-Cas: biology, mechanisms and relevance. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2016 Nov 5;371(1707):20150496.

5 Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017 Aug;18(8):495-506.

6 Noncanonical views of homology-directed DNA repair. Genes Dev. 2016 May 15;30(10):1138-54.

7. Non-Homologous End Joining and Homology Directed DNA Repair Frequency of Double-Stranded Breaks Introduced by Genome Editing Reagents. PLoS One. 2017 Jan 17;12(1):e0169931.

8. https://sg.idtdna.com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-crispr-cas9-system#sfs-tab-panel-1

9. https://sg.idtdna.com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-crispr-enzymes#performance_sq

10. https://sg.idtdna.com/pages/products/crispr-genome-editing/alt-r-crispr-enzymes#performance_sq