Introduction

环磷酰胺（CTX）是一种广泛用于治疗恶性肿瘤的烷基化化疗药物。然而，它也有许多副作用，比如对免疫作用的抑制和肝损伤。肝脏是重要的器官，在机体的代谢功能和外源性物质的解毒中起着不可替代的作用。外源性肝损伤物质，如细菌、病毒、化疗药物和代谢物，会产生过量的活性氧（ROS），引起炎症、肝硬化和肝病。氧化应激在介导CTX诱导的肝损伤中起重要作用。CTX进入人体后，被肝微粒体酶转化为丙烯醛、磷酰胺芥等活性代谢产物。丙烯醛很容易导致人体抗氧化防御系统的衰退，破坏机体功能及内外环境稳态。因此，有必要寻找一种有效的、毒性很小的天然抗氧化剂来缓解CTX引起的肝损伤。

近年来，从植物、动物和真菌中提取的多糖因其高效、无毒的特性受到广泛关注。此外，具有多种生物活性的多糖已被广泛研究以预防CTX引起的肝损伤。凉粉草是我国常用的药食两用植物资源，具有较高的营养价值和潜在的保健功能。凉粉草多糖（MP）是凉粉草的主要活性成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、降压和抗病毒活性。早期的研究表明，凉粉草多糖可以减轻CCl4引起的肝损伤。

肠道菌群与宿主的健康息息相关。由于肠-肝轴的存在，肠道和肝脏会相互影响。当肝脏受损时，肠道微生物组成和肠道上皮细胞的完整性可能被破坏，肠道微生物群的异常变化会导致多种慢性炎症疾病。近期研究表明，血浆内毒素升高与肠内脂多糖（LPS）转运有关，急性肝功能衰竭患者易发生内毒素血症。尽管膳食纤维和多糖难以被人体消化道中的酶消化，但它们可以被肠道菌群发酵成短链脂肪酸（SCFAs）。SCFAs作为必需的营养来源，可用于维持肠道稳态，对改善慢性炎症性疾病、保护肠黏膜、促进结肠细胞健康具有重要意义。因此，我们推测MP可能对CTX诱导的肝损伤具有潜在的治疗作用，此外，MP可以通过刺激特定肠道细菌的数量和活性来缓解肝损伤。

谢建华教授团队 考察了MP对CTX中毒小鼠肝脏的治疗作用。同时，还研究了MP对CTX中毒小鼠肠道菌群结构和组成的影响，可以为凉粉草治疗环磷酰胺中毒提供指导。

Results and Discussion

MP对小鼠体重和肝指数的影响

MP对CTX诱导的肝损伤小鼠体重的影响如图1B所示。NC组在实验过程中体重呈上升趋势，MC组小鼠经CTX治疗后体重显著下降（P < 0.01），表明CTX对小鼠造成了严重损伤。然而，小鼠在MP治疗后体重恢复，表明MP缓解了CTX引起的体重减轻。肝脏指数也观察到了相同的现象（图1C），与其他治疗组相比，MC组的肝脏指数显著降低（P < 0.05）。而不同剂量的MP治疗显著促进了肝脏指数的增加（P < 0.05）。本研究表明，MP可以显著逆转CTX引起的小鼠体重和肝脏指数的降低。

（A）无菌生理盐水处理的小鼠（NC）和CTX诱导的肝损伤小鼠给予不同剂量的MP或左旋咪唑（LMS，40 mg/kg·bw）；（B）体重；（C） 肝脏指数；（D）血清中AST和ALT的活性。

图1MP对CTX致小鼠肝损伤的影响

MP对肝功能指标的影响

血清AST和ALT是肝损伤的特异性指标，如图1D所示，与NC组相比，MC组血清AST和ALT水平显著升高（P < 0.05），表明药物模型成功建立了CTX小鼠的肝损伤。相比之下，LMS组与NC组之间无显著差异（P > 0.05）。此外，与MC组相比，MP 200组在200 mg/kg·bw剂量下抑制了AST和ALT水平（P < 0.05）。这些结果表明MP对肝功能起到了保护作用。本研究表明，当肝脏受到压力或损伤时，细胞膜的通透性增加，细胞质和线粒体中的酶会溢出细胞进入血液，引起血酶活性的病理性增加。因此，ALT和AST常用于肝损伤生化标志物的早期评估。

肝脏组织病理学分析

组织病理学研究进一步证实了MP对肝脏的保护作用，NC组H&E染色肝切片显示肝小叶结构正常且界限清楚，以中央静脉为中心，肝细胞呈放射状排列（图2A）。相反，MC组肝细胞结构异常，中央静脉和肝窦充血明显，并伴有大量炎性细胞浸润（图2B）。LMS保护了由CTX引起的肝脏组织病理学变化（图2C）。与MC组相比，不同剂量的MP对肝脏组织有不同程度的改善。MP 50和MP 100组也出现了少量炎症细胞浸润和中心静脉充血的现象，而MP 200组恢复至与NC组接近，说明高剂量MP对肝损伤有更好的保护作用。

（A）NC组、（B）MC组、（C）LMS组、（D）MP 50组、（E）MP 100组、（F）MP 200组。

图2MP对CTX诱导的小鼠肝损伤组织学成像的影响

肝脏氧化应激

MC组SOD和GSH-Px活性较NC组显著降低（P < 0.05）。随着MP浓度的增加，GSH水平显著升高（P < 0.05）。在MC组中，MDA（脂质过氧化物的终产物）的浓度表现出显著增加的趋势（P < 0.05）。所有这些结果表明MP对CTX引起的肝损伤具有保护作用，这可能是通过抗氧化能力的增强和脂质过氧化物产生的减少实现的。目前的研究表明，CTX诱导的肝损伤通过形成ROS和脂质过氧化物，从而降低抗氧化酶活性。在这项研究中，CTX治疗的肝损伤小鼠的MDA浓度显著增加。MP治疗可显著提高肝脏中GSH、SOD和GSH-Px的活性，减少MDA的产生，并呈现剂量依赖性。综上所述，MP具有一定的保肝功能，其保肝作用可能与降低氧化应激有关。

（A） SOD, （B） GSH-Px, （C） GSH, （D） MDA。

图3MP对CTX诱导小鼠肝损伤氧化应激指标的影响

炎症细胞因子和LPS浓度

炎症细胞因子是肠道免疫系统的关键信号分子，在肝炎的发生中起重要作用。MP对肝脏中IL-6和TNF-α水平的影响如图4A和B所示。与NC组相比，CTX增加了肝脏中IL-6和TNF-α的释放。但与MC组相比，LMS组炎性细胞因子水平显著降低（P < 0.05）。同时，MP 50、MP 100和MP 200组IL-6和TNF-α的释放显著低于MC组（P < 0.05）。这些结果证明MP可以逆转由CTX引起的小鼠肝脏炎症细胞因子的增加释放。

当肝脏受到有害物质损伤时，肠道通透性增加，黏膜损伤程度增加，大量LPS通过门静脉进入肝脏，不仅会直接对肝细胞造成损伤，而且会释放促炎细胞因子。在这项研究中，CTX促进了肝脏中IL-6和TNF-α的释放以及血清LPS浓度的增加。而MP抑制了CTX诱导的小鼠体内IL-6、TNF-α和LPS的释放，这表明MP可以减轻CTX诱导的炎症并减轻LPS介导的肝损伤。

（A） IL-6, （B） TNF-α, （C） LPS。

图4MP对小鼠肝脏炎症细胞因子产生和CTX诱导的血清LPS浓度的影响

小鼠结肠内容物中的SCFAs

短链脂肪酸，包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸，是肠道微生物在肠道内发酵产生的多糖的主要代谢产物，对人体健康有益。MP处理后总SCFAs浓度增加，这主要是由于乙酸、丙酸、丁酸和戊酸浓度增加所致（表1）。与NC组相比，MC组乙酸浓度显著降低（P < 0.05）。与MC组相比，丁酸和戊酸的浓度略有增加。这些结果表明，较高剂量的MP更有利于SCFAs的产生。研究表明，CTX显著减少了SCFA的产生。因此，有必要进一步探讨MP对CTX致肝损伤小鼠肠道菌群组成的影响。

表1MP对CTX诱导的小鼠结肠内容物中SCFAs的影响

肠道微生物组成和多样性

越来越多的研究表明，多糖可以调节肠道微生物结构，预防疾病。本研究通过16S rRNA测序研究MP对小鼠肠道菌群组成的影响。丰度等级曲线（图 5A）表明肠道微生物群具有高丰度。与NC组相比，MC组的Shannon多样性指数显著降低（P > 0.05）。这些结果表明MP增加了肠道微生物群的多样性。

肠道微生物群在宿主的生理学和病理学中起着至关重要的作用。MP摄入量可以增加肠道微生物群的多样性并促进某些特殊细菌属的生长。β-多样性分析表明CTX治疗组与正常组明显分离。MP干预偏离了CTX治疗组，表明MP确实可以调节肠道微生物群落。这些结果表明MP可以改变肠道微生物群的组成（图5B）。层次聚类结果表明NC和MC组有不同的微生物组成，聚集的MP 200组更接近NC组（图5C）。这些结果进一步证实MP可以改变CTX诱导的小鼠粪便菌群的组成。样本的聚合表明各组之间的相似性和三组之间的独立性（图5D）。

为了确定与MP相关的特定分类群，在门、科和属水平上评估了相对丰度。在门水平上，3 组微生物群落的结构主要由厚壁菌门和拟杆菌门组成，其次是变形菌门（图6A）。与NC组相比，MC组厚壁菌门和拟杆菌门的丰度无明显变化（P > 0.05）。补充MP后，厚壁菌门的丰度显著增加（P < 0.05），而拟杆菌门的丰度显著降低（P < 0.05），表明MP对小鼠肠道微生物群组成有显著影响。然而，变形菌的丰度在三组中没有显著改变（图6B）。

图6C显示了所有组中家族水平的肠道微生物群的变化。在家族水平上，施用MP逆转了CTX引起的瘤胃球菌科丰度下降。分类的梭菌在NC组和MC组之间没有显著差异（P < 0.05）。MC组乳杆菌的丰度显著高于NC组，200 mg/kg·bw的MP给药量显著减少（P < 0.05）（图6D）。本研究的结果表明，CTX诱导的肝损伤小鼠中拟杆菌科的丰度显著增加。综上所述，MP对CTX诱导的小鼠肝损伤的保护作用可能是通过改变肠道菌群的组成，进而增加了SCFAs，减少了炎症反应。

为了验证所有组肠道微生物群的差异，分析和比较了几个属水平的粪便微生物群。如图6E所示，NC组和MP 200组的优势菌比较相似，MC组中乳酸杆菌和拟杆菌的丰度高于NC组。此外，NC组和MP 200组中颤螺菌属的丰度与MC组相似且高于MC组，但没有显著差异（图6F）。进行线性判别分析效应大小（LEFSe）分析以鉴定具体改变的细菌表型表明补充MP增加了CTX在小鼠体内诱导的12 个细菌分类群（图7）。

肠道中的微生物可以通过不同的机制影响肝脏，例如代谢物（SCFA）的产生和免疫调节，与CTX治疗组相比，MP治疗可以抑制LPS水平的增加，从而抑制肝组织的炎症。相关研究表明，丁酸能够抑制中性粒细胞释放，降低NF-κB活化，抑制单核细胞和淋巴细胞与内皮细胞的粘附，表明SCFAs可能通过抑制炎性细胞因子的表达发挥抗炎作用。因此，探究MP在调节肠道微生物群中的作用非常重要。

表2MP对OTU和α-多样性指数的影响

（A）每个样品的丰度等级曲线，（B）基于未加权UniFrac距离的NMDS分析，（C）基于未加权UniFrac距离的分层聚类结果分析，（D）PLS-DA分析。

图5MP对CTX诱导小鼠肠道菌群丰度等级曲线和多样性的影响

（A）门水平的肠道微生物群组成，（B）在门水平上肠道微生物群的相对丰度，（C）家庭水平的肠道微生物群组成，（D） 家庭层面肠道微生物群的相对丰度，（E）每组属水平的热图分析，（F）在属水平上肠道微生物群的相对丰度。

图6MP对CTX 诱导的小鼠肠道微生物群组成的影响

（A）用于肠道微生物群分类的分支图。（B）分类直方图显示了为OTU级别的特征计算的LDA分数。

图7MP对肠道微生物群结构和关键系统发育的影响

Conclusion

总之，本研究表明MP对CTX诱导的肝损伤可以通过减少氧化应激和炎症反应来发挥其保护作用。补充MP可以改善CTX诱导的肝损伤小鼠的肠道菌群组成。MP能够通过提高抗氧化状态、抑制炎症反应和调节肠道菌群，有效地抑制了CTX诱导的肝损伤。这些发现为MP作为功能性食品的健康影响提供了新的视角。

Mesona chinensisBenth polysaccharides alleviates liver injury by beneficial regulation of gut microbiota in cyclophosphamide-induced mice

Yuzhen Hong, Mingyue Shen, Lixin Huang, Ting Wu, Jianhua Xie*

State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China

*Corresponding author.

E-mail address: jhxie@ncu.edu.cn

Abstract

There are a number of health benefits of Mesona chinensis Benth polysaccharide (MP), but little is known about its hepatoprotective effect and effect on gut microbiota composition in mice with liver damage induced by cyclophosphamide (CTX). This study indicated that MP supplementation effectively inhibited the production of serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT), enhanced liver antioxidant capacity and repaired liver damage in mice caused by CTX. The release of inflammatory cytokines in liver and the concentration of lipopolysaccharide (LPS) in serum were decreased, and the level of short chain fatty acids (SCFAs) in colon was increased after MP administration. Those effects may be correlated with the regulation of the gut microbiota. Importantly, MP restrained liver inflammatory responses induced by CTX may via increasing the SCFAs-producing bacteria family Ruminococcaceae and reduced LPS-producing bacteria genus Bacteroides. In short, the prevention of CTX-induced liver injury by supplementing MP is achieved at least in part by regulating the community structure of the gut microbiota, and MP is expected to be a potential prebiotic to treat and prevent liver diseases.

Reference:

HONG Y Z, SHEN M Y, HUANG L X, et al. Mesona chinensis Benth polysaccharides alleviates liver injury by beneficial regulation of gut microbiota in cyclophosphamide-induced mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(1): 74-84. DOI:10.1016/j.fshw.2021.07.009.

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于2022年5月7-8日在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。