新鲜果实经过压榨得到新鲜果汁能较完整地保留水果原有风味、营养物质和生物活性，且口感更好，深受消费者青睐。其中，柑橘汁色泽优美、营养丰富、芳香宜人，是世界上最受欢迎、贸易量最大的果汁产品，大约占据2/3的世界果汁市场。由于水果中富含大量的果胶、纤维素、半纤维素和淀粉等物质，从而造成果汁生产中果浆黏度高、出汁率低、难以澄清等问题，其中果汁澄清困难严重影响了果汁饮料的生产。
本实验室前期对察氏培养基、柚皮粉培养基以及茶梗培养基发酵制备的黑曲霉胞外酶液进行差异定量蛋白组学分析，得到差异蛋白α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因序列。集美大学食品与生物工程学院的彭 程、李清彪*等人对该α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶进行生物信息学分析，并将其异源表达、纯化，探究此重组酶的酶学性质及在柑橘果汁澄清中的应用潜力，以期为探究α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的其他应用提供材料和参考，同时也丰富α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的资源。
1、 AB基因的重组质粒构建及克隆表达
经PCR扩增目的基因的0.8%琼脂糖凝胶电泳结果如图1A所示。PCR产物在2 000 bp附近出现特异性条带。连接产物转化后所挑取的转化子进行菌落PCR鉴定，其1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1B所示，菌落1和5的PCR产物条带单一，且分子质量在2 000～3 000 bp之间，符合预期结果。提取菌落1和5的重组质粒委托铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序，测序结果显示，菌落1的目的片段正确插入载体中，表明已成功构建重组质粒pPIC9K-AB。
用UniProt数据库BLAST对相似性较高的前25 条氨基酸序列建立进化树，结果如图2所示。该酶（A0A100ITZ9）属于GH51，其氨基酸序列与来自Aspergillus kawachii（Q8NK90）、A. awamori（Q96X54）、A. niger（P42254.1）、A. sclerotioniger（A0A317XE43）、A. terreus（Q0CTV2）、A. ruber（A0A017S9M9）的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶分别具有99.5%、99.3%、97.3%、88.7%、78.1%、76.3%的相似性。
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的跨膜区预测结果（图3A）显示该蛋白不含跨膜区，是一种可溶性蛋白，适于分泌型表达。如图3B所示，该酶的二级结构以无规卷曲和β-折叠居多，其中氨基酸序列中α-螺旋占总二级结构的21.18%；β-折叠占24.52%，β-转角占5.73%，无规卷曲占48.75%。利用SWISS-MODEL对α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶进行同源建模，结果如图3C所示。本研究的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶序列与来源于Meripilus giganteus的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（PDB登录号6ZQ0）同源性为39.93%，故以它为模板进行同源建模。对所得蛋白质三级结构建模结果进行Verify3D评价，80%以上的氨基酸序列满足特定的评分标准得到分数，说明建模结果可靠。从结果可以看到蛋白质序列的得分比最小值为90.0%，说明该α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的蛋白质序列的建模结果良好。
2、重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的诱导表达、纯化及质谱鉴定
重组质粒pPIC9K-AB电转化至P. pastoris SMD1168感受态细胞后，破壁PCR鉴定结果如图4A所示，条带数量、大小均符合预期。PCR产物委托铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序，测序结果表明已成功构建重组菌株。
利用BMGY和BMMY培养基对重组菌株发酵培养，发酵7 d后的培养液，即为粗酶液。通过phenyl疏水柱、Q Sepharose HP阴离子交换柱、Superdex 200 Increase 10/300 GL凝胶过滤柱对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶进行纯化，Superdex 200 Increase 10/300 GL凝胶过滤柱纯化层析如图4B所示，呈现单一峰形。
如图4C所示，SDSPAGE凝胶上呈现单一条带。由纯化过程参数（表1）可看出，最后得到该重组蛋白的纯化倍数为5.13倍，比活力达到55.73 U/mg。从SDS-PAGE（图4C）切出相应的条带，并将进行胰蛋白酶水解的产物进行质谱分析。
通过LC-MS/MS鉴定分离的重组的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（图4D）。再通过MASCOT等质谱匹配软件对LC-MS/MS数据进行分析（FPGGNNLEGNSAENR、LANYGSETQDLSVSIPGTSTGK、GSVSEAVFmIGFER、SVPYFIGEYSR、ENGLKPQLANVLADMK、GDYSGDITVR），获得目标蛋白质多肽分子的定性鉴定信息。该重组蛋白鉴定为α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶A（A. niger），UniProt数据库登录号为A0A100ITZ9。
3、温度对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的影响
如图5A所示，重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在40～80 ℃范围内均有活性，最适反应温度为65 ℃。如图5B所示，重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在65 ℃处理90 min后，仍能保持60%以上的酶活力，在70 ℃处理10 min，酶活力仅有65%左右。相关研究报道，来源于Pseudopedobacter saltans、Bifidobacterium longum B667、B. breve K-110、Ruminiclostridium josui、Clostridium thermocellum的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的最适温度分别为50、45、45、45、50 ℃。
与相关文献报道的同类酶相比，本研究发现的耐热酶最适温度更高，热稳定性也更好，更有利于工业应用。该酶耐热性的原因可能与其紧密的结构相关，该酶桶状结构与β-三明治结构域紧密结合（图3C），桶的C端与N端处于同一β-折叠结构域中，因此其具有良好的耐热性。
4、 pH值对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的影响
如图5C所示，随着pH值的升高，酶活力呈先上升后下降的趋势，在乙酸钠缓冲体系中活力较高，在pH 5.0时α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力最高。如图5D可知，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在pH 3.0～8.0范围内处理24 h后均保持一定的活力，且较窄的pH值范围（pH 4.0～8.0）条件下放置24 h后仍保持约70%的酶活力。该结果表明该重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在弱酸性和中性范围内具有良好的pH值稳定性；这与真菌来源的酶通常最佳pH值在酸性范围内的规律相符合。
5、重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的底物特异性及动力学常数
通过测定重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在不同浓度pNPA（1～6 mmol/L）活力，计算得到的初始反应速率，利用Lineweavere-Burk法计算获得酶促反应参数K m 值和V max 值分别为2.31 mmol/L和625 μmol/（mL·min）。来源于A. niger ND-1的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的K m 为5.36 mmol/L，与之相比，本研究中的重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的K m 值更低，表明该酶与底物的亲和力更大，可以作为工业应用的理想选择。
6、金属离子、抑制剂和表面活性剂对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力的影响
金属离子的存在可能多方面的影响酶活力，通过测定重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶被不同金属离子处理后残留的酶活力探究金属离子对其影响，结果如图6A所示。1 mmol/L的金属离子K+对α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶有轻微促进作用，其酶活力提高了11%。该结果表明，K+离子可用作该酶的活化剂，可用于进一步的研究和开发。而1 mmol/L的Cu2+、Al3+却能明显抑制该酶活力性，其酶活力均低于50%。
探究抑制剂和表面活性剂对酶活力的影响，结果如图6B所示。由于EDTA的添加对酶活力没有显著影响，这一结果表明酶的活性不需要金属离子辅助。重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的CTAB耐受能力较差，1 mmol/L的CTAB能使α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基本失活，尿素对α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力有轻微抑制作用，而SDS对α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力有轻微促进作用。低用量Tween-20能轻微促进酶活力，而1%的Tween-80、Triton X-100存在时，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力仅有80%以上，但高浓度条件下均抑制α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力。
7、重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶对单糖耐受性及对柑橘汁的影响
由图7可知，低浓度（＜400 mmol/L）时，L-阿拉伯糖的存在对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力有轻微促进作用。随着浓度进一步升高，L-阿拉伯糖存在对重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力产生抑制作用，在1 000 mmol/L的浓度下，L-阿拉伯糖的抑制百分比为24.2%，比Hu Yanbo等研究来源于Paenibacillus polymyxa KF-1的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（500 mmol/L，26.1%）的抑制效果更小。重组α-L-阿拉伯呋喃糖对柚子汁有澄清作用，加酶量为15 U/mL时，效果最好，其澄清度提高了15.18%，但随着加酶量的增加，透光率却下降。与高佳等研究的果胶酶处理酸樱桃果浆的结果一致。相关学者对此的解释是使用的酶本质为蛋白质，蛋白过量会使果汁产生一定程度的浑浊，从而使果汁的透光率下降。
结 论
对A. niger的AB基因（UniProt：A0A100ITZ9）进行克隆并在毕赤酵母中进行异源表达后得到大小为85 kDa的重组蛋白。通过疏水柱、阴离子交换柱、分子筛等对重组蛋白进行纯化后，其比活力为55.73 U/mg。最适反应温度和pH值分别为65 ℃和5.0，在pH 4.0～8.0稳定性较好。金属离子K+对酶活力有促进作用，而Cu2+对酶活有明显的抑制作用；以4-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷为底物时测得该酶的Km值和Vmax值分别为2.31 mmol/L和625 μmol/（mL·min）；加酶量为15 U/mL时，对柚子汁的澄清效果最好，其澄清度提高了15.18%。本研究不仅丰富了现有的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶资源库，同时为后续探究α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的应用提供了重要的理论参考。
本文《一种黑曲霉α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶克隆表达、性质分析和果汁澄清效果》来源于《食品科学》2022年43卷2期83-92页，作者：彭程，肖文熙，倪辉，李利君，谭万森，林燕玲，李清彪。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201105-052。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于2022年5月7-8日在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。
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