在当今社会，随着环境污染对食品安全造成越来越大的影响，食品安全的概念越来越深入人心。我国每年有关水产品“三鱼两药”的质量安全问题时有发生，其中孔雀石绿超标已成为影响水产品质量安全的重要因素之一，对人类健康造成严重威胁。因此，有效控制水产品中的孔雀石绿对于提高水产品安全性具有非常重要的意义。
有研究报道称，孔雀石绿可以作为唯一的碳源被微生物利用，然而在葡萄糖、半乳糖、蔗糖的条件下对孔雀石绿降解的影响目前还缺乏相关的研究报道。基于此，中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心的田小丽、李春生、陈胜军*等以筛选出的高孔雀石绿降解能力菌株为研究对象，系统研究葡萄糖、半乳糖、蔗糖等碳源对孔雀石绿脱色和降解特性的影响，并对孔雀石绿降解过程进行分析，旨在为后期该菌株降解孔雀石绿的应用提供理论基础。
1、菌株鉴定
选择到目前为止发表在EzBio Cloud Database中Klebsiella内共18 种标准菌株的16S rRNA基因序列与WA-1的16S rRNA基因序列构建系统进化树，结果如图1所示，菌株WA-1的16S rRNA基因序列与K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis ATCC 13884T的距离最近，两者同源性为99.51%。VITEK 2 GN卡鉴定结果如表1所示，WA-1菌株符合K. pneumoniae的典型性反应，相似度为99%。综合分子生物学鉴定和生理生化鉴定结果，最终确定所分离的孔雀石绿降解菌株WA-1为K. pneumoniae，重新命名为K. pneumoniae WA-1。
2、不同碳源对菌株在含孔雀石绿盐培养基中生长的影响
如图2所示，加入葡萄糖、半乳糖、蔗糖等不同碳源时，菌株生物量均大于初始接种量，说明菌株能利用碳源进行生长。而在纯盐培养基条件下，菌株以孔雀石绿为唯一碳源时的生物量无显著差异，均接近0.1 g/L，可能是因为培养基中碳源质量浓度过低。在0～20 mg/L孔雀石绿质量浓度条件下，蔗糖对菌体生物量的提高最大。随着孔雀石绿质量浓度逐渐上升至40 mg/L，葡萄糖对菌体的生物量逐渐增加，这表明高质量浓度的孔雀石绿可能促进菌体对葡萄糖的利用，从而转化成生物量；而以蔗糖为碳源时，生物量却显著下降，这表明高质量浓度孔雀石绿可能抑制菌体对蔗糖的利用。以半乳糖为碳源时，不同质量浓度孔雀石绿对菌株生物量无显著影响。
3、不同碳源对菌株孔雀石绿生物脱色的影响
加菌前后培养基直观的颜色变化可以看出，加菌前，培养基颜色随着孔雀石绿质量浓度的增加而逐渐加深；加菌后，4 种培养基均变为无色，说明菌株对孔雀石绿具有很强的生物脱色作用（图3A）。在1～40 mg/L范围内，孔雀石绿质量浓度与吸光度呈现良好的线性关系，相关系数R2为0.999 7，表明分光光度法能够准确评价菌株的孔雀石绿生物脱色作用。
图3 B～E结果发现，K. pneumoniae WA-1对孔雀石绿具有很强的生物脱色作用。在不加碳源时，随着孔雀石绿质量浓度不断增加，孔雀石绿脱色率有所下降，但是脱色率仍能达到99%。这样的孔雀石绿脱色效果在其他已报道菌株中很难达到：在盐培养基中，菌株Pandoraea pulmonicola YC32在30 min内对10 mg/L孔雀石绿的脱色率只有25%；Pseudomonas aeruginosa NCIM 2074在孔雀石绿质量浓度为50 mg/L的盐培养基中脱色率仅有5%。在添加葡萄糖、蔗糖、半乳糖后，孔雀石绿脱色率有所提高，均接近100%。
4、不同碳源对菌株孔雀石绿生物降解的影响
从图4A可以看到，其还原产物隐性孔雀石绿在8.509 min左右处具有最高峰，峰形对称、尖锐，说明隐性孔雀石绿在此条件下具有较好的分离度。根据孔雀石绿质量浓度与峰面积的标准曲线可知，在0.002 5～4 mg/L范围内，孔雀石绿质量浓度与峰面积具有线性关系，标准曲线方程为y=417.47x＋12.172，相关系数R2为0.999 6。
如图4B～E所示，菌株在盐培养基中依然表现出很强的孔雀石绿降解能力，在24 h内对5～40 mg/L孔雀石绿的降解率超过94.43%。与盐培养基相比，葡萄糖、半乳糖、蔗糖等碳源的添加显著抑制了菌株的孔雀石绿降解，特别是在低孔雀石绿质量浓度（5 mg/L）时，其孔雀石绿降解基本完全抑制。
5、不同碳源对菌株孔雀石绿还原酶活力的影响
如图5所示，盐培养基中孔雀石绿还原酶活力较高，达到54.93 U/mL。与孔雀石绿脱色效果变化相似，添加葡萄糖、半乳糖、蔗糖等碳源后孔雀石绿还原酶活力显著增加，其中，添加蔗糖的酶活力最大，达到159.64 U/mL。研究表明，Ochrobactrum sp.主要通过细胞外分泌的孔雀石绿还原酶使孔雀石绿发生生物脱色作用，这与本研究的结果一致。
6、不同碳源对菌株孔雀石绿脱色和降解的影响机制
综合上述实验结果，探究了不同碳源对菌株K. pneumoniae WA-1孔雀石绿脱色和降解的影响机制（图6）。孔雀石绿还原为隐性孔雀石绿一般被认为是孔雀石绿降解的第1步反应。本研究同样发现，孔雀石绿首先在菌株分泌到细胞外的孔雀石绿还原酶作用下还原成隐性孔雀石绿。在纯盐培养基中，大量隐性孔雀石绿利用ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）通过主动运输进入细胞，为了维持细胞正常生理代谢，隐性孔雀石绿作为唯一碳源被进一步降解和利用，从而表现出较高的脱色和降解效果。在添加葡萄糖、半乳糖、蔗糖等碳源后，菌株生物量和孔雀石绿还原酶活力的增加显著增加了孔雀石绿脱色能力，然而由于竞争性转运抑制的作用，隐性孔雀石绿转运能力下降，菌株选择更容易被分解的糖类，而对结构稳定的隐性孔雀石绿需求下降，最终表现出菌株孔雀石绿降解率的显著下降。
结 论
利用变色圈法筛选到1 株对孔雀石绿具有较强脱色和降解能力的细菌，经过分子生物学和生理生化鉴定，确定该菌为K. pneumoniae WA-1。与盐培养基相比，添加葡萄糖、半乳糖、蔗糖等碳源时孔雀石绿（5～40 mg/L）的脱色率有所提高，均接近100%，这可能与菌株生物量和细胞外孔雀石绿还原酶活力提高有重要关系。菌株在盐培养基中表现出很强的孔雀石绿降解能力，在24 h内对5～40 mg/L孔雀石绿的降解率超过94.43%。添加葡萄糖、半乳糖、蔗糖等不同碳源显著抑制了菌株的孔雀石绿降解，特别是在低孔雀石绿质量浓度（5 mg/L）时，其孔雀石绿降解基本完全抑制。探究菌株的孔雀石绿脱色和降解过程，孔雀石绿首先在细胞外在孔雀石绿还原酶作用下还原成隐性孔雀石绿，然后通过ABC转运蛋白进入细胞，被进一步降解和利用。本实验为K. pneumoniae WA-1的孔雀石绿降解机制研究提供重要思路，也为后期该菌株降解孔雀石绿的应用提供重要理论基础。
本文《不同碳源对Klebsiella pneumoniae WA-1孔雀石绿脱色和降解的影响》来源于《食品科学》2022年43卷6期181-188页，作者：田小丽，李春生，陈胜军，薛勇，邓建朝，潘创，王悦齐。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210115-166。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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