Introduction

在海鲜加工中，有大量的副产品，包括皮肤、内脏、鳞片和骨头。对鱼肉和鳗鱼副产品化学成分的比较研究表明，这些未被充分利用的副产品富含蛋白质和功能性油脂，欧洲鳗鱼骨含有约13.25%的粗蛋白质、19.18%的粗脂质、5.63%的粗灰分和56.96%的水分。鱼骨占海洋食品工业副产物中很大的一部分。因此，如果加工得当，这些原材料可以用于各种产品和材料。

钙占全身重量的1.5%~2.0%，其中99%用于生成骨骼和牙齿，是人体重要的微量元素。钙进入细胞后，会控制许多细胞活动，如新陈代谢、收缩、肌肉的生长发育、心跳、细胞分裂、大脑思维、凝血和内分泌活动。钙的缺乏会导致骨质疏松症，甚至导致高血压、肾结石和结肠癌等疾病。通过饮食摄入足够的钙可以降低风险。研究发现，蛋白质和肽对钙的吸收有积极作用，鱼骨衍生肽表现出良好的钙螯合能力。目前，鱼骨被认为是经济价值较低的加工副产品，它含有30% 的胶原蛋白，可视为蛋白质和多肽的优质来源。

Caco-2是一种人类结肠癌细胞系，已广泛用于评估体外抗CRC（肠癌和结肠癌）的抗肿瘤潜力。细胞凋亡是一种依赖于半胱天冬酶的程序性细胞死亡，主要伴随染色体收缩、核碎裂和内部磷脂酰丝氨酸 (PS) 向膜表面的转化和凋亡小体。有研究表明，金属元素和鱼骨多肽的组合具有较强的抗肿瘤潜力，可以将其开发为治疗CRC的新化疗组合。

本研究从欧洲鳗鱼骨中提取多肽，并与钙螯合。为了更好地了解鳗鱼骨肽螯合钙（EBPC-Ca）的营养成分和潜在生物活性，对骨肽粉和 EBPC-Ca之间的矿物质成分和脂肪酸进行了总体比较。分析了EBPC-Ca对Caco-2细胞增殖、凋亡诱导和ROS爆发的影响，并评估了它们的抗CRC潜力。

Results and discussion

基本成分及氨基酸组成分析

表1给出了欧洲鳗鱼骨粉，鳗鱼骨多肽粉和鳗鱼骨多肽螯合钙粉的基本成分信息，表2展示了EB、EBCP和EBPC-Ca的氨基酸组成。可看出EBPC-Ca的钙含量明显高于EBCP，说明鳗骨多肽对钙离子有良好的螯合作用。对比EBCP和EBPC-Ca的氨基酸组成发现，带负电荷的氨基酸（Glu和Asp）的羧基、带正电荷的氨基酸（Lys、Arg和His）的残基和疏水性氨基酸残基在肽钙结合过程中起关键作用。

表1 欧洲鳗鱼骨、骨肽和肽钙螯合物的基本成分

表2EB、EBCP和EBPC-Ca中氨基酸组成比较

粒径分布及紫外-可见光谱分析

图1展示了EBCP 和 EBPC-Ca 复合纳米粒子的粒径分布及紫外-可见光谱吸收特性。与EBCP相比，EBPC-Ca复合物的粒径部分较大，表明EBCP与钙离子之间发生了结构折叠。在UV-Vis吸收光谱中，EBPC-Ca的结构变化也得到了很好的验证（图1B），EBPC-Ca 复合物的形成能够诱导肽的聚集和折叠变化。

图1EBCP和EBPC-Ca复合物的粒径分布(A)和紫外-可见光谱分析(B)

EBPC-Ca对Caco-2细胞增殖的影响

图2包括EBPC-Ca对Caco-2细胞的毒性分析图（图2A），EBPC-Ca处理细胞后的荧光倒置显微镜图（图 2B），Annexin V-FITC /PI染色的细胞分布图（图2C），DCFH-DA分析检测活性氧（ROS）及EBCP-Ca处理后对细胞活力的抑制作用（图2D）以及流式细胞技术对细胞周期的检测图（图2E）。以此可见，EBCP-Ca的毒性不强，但可以促进Caco-2细胞凋亡。EBPC-Ca联合处理培养细胞24 h并没有改变具有激活的受体相互作用蛋白激酶1（RIP-1，坏死的关键调节因子之一）的细胞数量，FGF-23蛋白的表达证实EBPC-Ca不会触发Caco-2细胞的坏死。此外，用EBPC-Ca处理的细胞活力更高，这表明EBPC-Ca对细胞活力的抑制作用部分是由ROS水平的提高引起的。对细胞周期的影响而言，EBPC-Ca处理显着增加了G1期的细胞部分，并减少了S期的细胞部分。

图2 EBPC-Ca 对Caco-2细胞增殖的影响

Caco-2细胞中的Ca2+积累

图3展现了Caco-2细胞中钙摄取和保留率的定量和可视化。Ca2+通过激活某些蛋白激酶和核酸酶介导细胞凋亡，并与细胞凋亡的诱导有关。茜素红S染色用于研究EBPC-Ca处理1 d后Caco-2细胞中钙的积累。基于染色强度，对钙积累进行定量。由于茜素红染料对积累的矿物质的染色，细胞的钙积累随剂量的增加而增加。

图3Caco-2细胞中钙摄取和保留率的定量和可视化

Caco-2细胞线粒体膜电位及蛋白表达

图4为Caco-2细胞线粒体膜电位变化（图4A）及FGF-23表达水平的蛋白质印迹结果（图4B）。正常的线粒体膜电位是向细胞提供能量的先决条件。当发生早期凋亡时，线粒体膜电位降低。单体JC-1染料发出绿色荧光，表明线粒体膜电位较低。聚集的JC-1发出红色荧光，表明线粒体膜电位更高。，随着EBPC-Ca的浓度升高处理细胞，红色荧光逐渐降低，反而绿色荧光逐渐增加，说明EBPC-Ca对细胞生长有显著的影响。FGF-23表达水平的蛋白质印迹结果显示，与对照相比，当EBPC-Ca浓度超过2.0 mg/mL时表达水平显着升高，表明较高浓度的EBPC-Ca可以增强Caco-2细胞的吸收特性。

图4JC-1染料检测到的线粒体膜电位（A）及EBPC-Ca处理7天后Caco-2细胞中FGF-23表达模式的变化

Conclusion

欧洲鳗骨肽螯合钙（EBPC-Ca）能够以浓度和时间依赖性方式抑制人结直肠腺癌细胞（Caco-2）的增殖。结果表明，EBPC-Ca的添加显着增强了抗细胞增殖活性，但细胞活力和药物暴露时间显着降低。EBPC 和钙离子的螯合化合物引发强烈的细胞凋亡，这可能是自噬通量受阻的结果。对于未配对的自噬，药物组合的显着促氧化作用导致线粒体功能的破坏，导致细胞凋亡。此外，发现细胞死亡的途径与由ROS积累、Ca2+浓度、代谢异常和蛋白质表达诱导的线粒体功能障碍有关，这些因素相互作用促进并最终导致细胞死亡。

第一作者简介

滕慧，博士，广东海洋大学食品科技学院，副教授。毕业于韩国庆北大学（世界排名54），食品生物技术专业。先后主持国家自然科学基金、中国博士后基金面上项目、福建省和广东省自然科学基金面上项目，持续开展食品安全与分子营养研究，以食品中有害产物的产生和控制为核心内容，在国际期刊上已发表论文54 篇，其中第一作者或通讯SCI论文37 篇(一区18篇)，EI 4 篇。包括Food Chemistry、Food and Chemical Toxicology、Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Trends in Food Science & Technology，5篇入选ESI高被引论文。

通信作者简介

田玉庭，男，福建农林大学食品科学学院教授/博导，百千万人才工程省级人选，中国食品科学技术学会食品装备与智能制造分会理事、传统酿造食品分会理事，福建省酒业协会专业技术委员会委员，福建特色海产加工产业化科技创新团队负责人。主持承担国家自然科学基金、博士后基金特别资助、省高校产学科技重大项目等课题10多项。以第一发明人授权国家发明专利17项，研究成果获省科技进步一等奖1项、二等奖3项、三等奖2项。

陈雷，男，广东海洋大学教授，博士生导师，主要研究领域包括植物化学物质、海洋营养物质和微量营养素的生物利用度，重点研究天然小分子类化合物的吸收和代谢机制。兼职担任Frontiers in Pharmacology (IF:5.810/Q1)和Food Science and Human Wellness (IF: 8.022/Q1)期刊编委；客座主编Oxidative Medicine and Cellular Longevity (IF:6.543/Q2), Frontiers in Pharmacology (IF:5.810/Q1), Canadian Journal of Gastroenterology and Hepatology (IF=3.522/Q2)专刊。参与组织2020年和2021年“医药与食品中的植物化学物质国际会议”（ISMPF），担任“International association of dietetic nutrition and safety（IADNS）”秘书。以第一或通讯作者发表的SCI/EI论文70余篇，其中一区论文30篇，IF>10的12篇，ESI前1%高被引论文7篇，热点论文（Hot paper）2篇，论文总被引>2000次，H-index 22，撰写英文专著2部。主持国家自然科学基金面上项目、青年基金、中国博士后面上项目等5项；参与国家/省部级课题10余项。

Nutritional properties of Europen eel (Anguilla anguilla) bone peptide-calcium and its apoptosis effect on Caco-2 cells

Hui Tenga,b,1, Yuewei Qianb,1, Xiaoyun Fana, Hui Caoa, Yuting Tiana,*, Lei Chena,b,*

aGuangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety, Guangdong Province Engineering Laboratory for Marine Biological Products, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Seafood, Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Product of Guangdong Higher Education Institution, College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China

bCollege of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

*Corresponding author:

E-mail: tytfst@163.com; chenlei841114@hotmail.com

Abstract

The present study aimed at making a rational usage for European eel bone by-products by preparing Europen eel bone peptide chelated calcium (EBPC-Ca). Nutritional properties and bioactivity of EBPC-Ca were evaluated. Results showed that nutritional properties of calcium ions will cause intra- and inter-molecular folding and aggregation of peptide to uniformly form EBPC-Ca chelate. The chelated compound of EBPC and calcium ion triggered a strong apoptosis in heterogeneous human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) in concentration- and time-dependent manners. Western blot analysis revealed that the EBPC-Ca induced apoptosis may be the result of a blocked autophagy flux through mitochondrial-dependent pathway. Additionally, the increase in FGF-23 protein expression inhibited the absorption of calcium ions and alleviated cell apoptosis. It was also found that the cell apoptosis occurs with significant increases in the levels of reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ in the cells, indicating the anti-tumor potential of EBPC-Ca may involve multiple channels.

Reference:

TENG H, QIAN Y W, FAN X Y, et al. Nutritional properties of Europen eel (Anguilla anguilla) bone peptide-calcium and its apoptosis effect on Caco-2 cells[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(6): 1482-1490. DOI:10.1016/j.fshw.2022.06.005.

文章编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于 2022年12月3-4日 在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。