腐霉利（PRM）是一种低毒、廉价、高效的小分子农药，广泛用于防治果蔬等作物的灰霉病、菌核病。但是PRM的过量施用使其成为农药残留检出率和超标率较高的农药之一，尤其是韭菜超标现象严重。目前，监测PRM的标准方法为气相色谱-质谱联用法，该法虽准确、灵敏及重复性较好，但仪器昂贵操作复杂以及检测成本高限制了其应用。相比之下，基于抗原-抗体特异性结合的胶体金免疫层析技术（GICA）则因快速、简便、低成本及便携已被广泛用于小分子有害物的现场监测。

华南农业大学食品学院的何晓婷，陈子键，徐振林*等在前期制备出PRM特异性纳米抗体（Nb）的基础上，系统研究金纳米颗粒（GNP）粒径、标记pH值、抗体标记量、检测液的pH值和离子浓度以及不同前处理程序对Nb GICA方法灵敏度和稳定性的影响，同时以单克隆抗体GICA方法为参照，探讨Nb替代传统抗体在GICA应用的可行性，以期为拓展Nb的应用前景提供依据。

1 胶体金探针的制备

抗体标记是影响GICA检测最为关键的技术要点，传统抗体的GNP表面功能化已经得到了非常广泛的研究，但是小尺寸的Nb相关例子相对较少。本研究重点研究了GNP粒径、标记pH值以及标记量对胶体金探针稳定性与生物活性的影响。

金纳米颗粒的鉴定与选择

传统的柠檬酸钠盐还原法制备胶体金，通过改变氯金酸与柠檬酸三钠质量比控制GNP的粒径。结果见图2，随着柠檬酸三钠用量的增加，其粒径越来越小，形状也越来越均一，外观颜色逐渐从紫红色变为橙红色。通过计算可知这5 种不同胶体金的平均粒径为（38±5）、（32±4）、（23±2）、（21±3）、（15±2）nm。

首先研究GNP大小对竞争性GICA检测显色效果与灵敏度的影响。其标记结果及试纸条效果见图3，复溶后GNP@mAbL005探针的颜色均为橙红色，其试纸条显色程度以及抑制率均随着粒径的减小而下降，其中最小粒径GNP的显色强度下降程度最为突出。当其标记抗体为尺寸较小的Nb时（图3b），其大粒径金标探针颜色及其试纸条显色偏紫黑，这种容易出现聚沉的现象也导致了较大的批间差异，因而其显色信号强度与抑制率的变化没有明显规律。但是值得注意的是，当其粒径较小时（＜20 nm），其探针颜色以及试纸条显色较为鲜红，且具有良好的再现性。故从胶体金的颜色、试纸条的显色程度以及灵敏度等方面综合考虑，分别选择粒径为（38±5）nm及（15±2）nm的GNP作为mAbL005以及NbFM5的标记载体进行后续实验。

标记pH值的优化

选择最佳粒径GNP，用0.2 mol/L的K 2 CO 3 溶液对胶体金溶液进行pH值调节，结果见图4，随着pH值的提高，两个体系的显色效果逐渐下降，其中GNP@mAbL005-GICA最为明显。pH值过低容易发生交联聚沉，维持这两个体系稳定的pH值范围有着明显差异，Nb在偏低pH值条件下（pH≤6）进行标记，会发生聚沉，离心后难以复溶，其试纸条显色发黑，而mAbL005在碳酸钾添加量极低的情况下也能维持稳定。本实验Nb选择（15±2）nm的GNP进行探针的制备。由于NbFM5的序列已知，通过在线软件工具ExPASy系统（http://www.expasy.org/）预测可知其等电点为7.05，而本实验在此pH值条件下恰好表现出最佳的抗体标记率。综上，分别选择在pH值为5及7的条件下对mAbL005以及NbFM5进行标记。

抗体标记量、探针体积与检测线浓度优化

分别固定GNP@mAbL005及GNP@NbFM5体系的质控C线羊抗鼠二抗及兔抗Nb二抗的质量浓度分别为0.79、1.10 mg/mL，先对其抗体标记量进行优化。结果见图5，NbFM5探针在低质量浓度抗体条件下（≤5.80 μg/mL）易发生聚沉死金的情况。竞争性免疫分析的灵敏度与免疫试剂质量浓度呈反比，提高探针的抗体标记质量浓度会降低其灵敏度。此外，两系统的显色程度表现出与抑制率相反的趋势，但是当NbFM5质量浓度达到13.52 μg/mL时，抗体质量浓度下其抗原抗体免疫复合物密度已经达到最大值。基于节约生产成本的考虑，选择9.66 μg/mL的NbFM5质量浓度进行标记。mAb与之相比，其在选择的实验质量浓度条件下一直未达到饱和状态，这可能是由于大粒径GNP对更多抗体的需求导致，最终选择显色程度及灵敏度相对较佳的10.76 μg/mL作为mAbL005最佳的标记质量浓度。

在最优的抗体量标记条件下进一步对探针体积以及检测线上的PRM-BSA质量浓度进行优化。以阴性T、C线读数以及阳性待测液的竞争抑制率用于确定最佳参数，其结果如表2所示，最佳组合如下：预处理20 μL/微孔的GNP@NbFM5探针，在NC膜上包被1 mg/mL PRM-BSA，结合胶体金抗体标记量可算得每孔需要190 ng NbFM5。在此优化的参数下，GNP@NbFM5在检测T线及质控C线上累积产生明显可见的红色条带，其OD值分别为1145和1007，20 μg/L PRM阳性样品的抑制率为89.5%。同样的策略也适用于GNP@mAbL005的优化，在最佳条件下，200 μg/L PRM阳性样品的抑制率为90.0%，其灵敏度低于GNP@NbFM5-GICA。此外，GNP@mAbL005-GICA每孔所需抗体量为158 ng，虽然稍低于NbFM5所需量，但是由于Nb可用原核生物进行大量表达，在生产成本上具有更大的优势。

2 试纸条检测条件的优化

探究了PB的pH值及离子浓度对NbFM5试纸条信号与灵敏度的影响，其结果如图6所示，试纸条在较低pH值条件下（pH≤6.4）会显色发黑，在缓冲液pH 7.4～9.4范围内，试纸条呈色良好且抑制率没有显著差异，这与标记pH值优化结果相对应。选择pH 7.4的缓冲液进一步探究缓冲液离子强度的影响，阴性的T线显色逐渐比C线强，当PB离子浓度为0.3 mol/L时，试纸条显色呈紫黑。综合显色效果与灵敏度，使用pH值为7.4，离子浓度为0.1 mol/L的PB进行GNP@NbFM5探针与PRM抗原的识别，在该条件下，其阴性T/C比值接近1且灵敏度达到最大值。

3 样品前处理优化

采用QuEChERS法对加标韭菜样品进行净化后获得的乙腈提取液分别进行吹干复溶后稀释以及直接稀释，拟合了直接稀释不同倍数下的标准曲线，并比较探针GNP@mAbL005及GNP@NbFM5在这两种不同前处理条件下的加标回收率，结果见图7。直接稀释10 倍（含10%乙腈）的条件下，GNP@mAbL005已经完全失活，因而无法进行检测。同样地，GNP@NbFM5的灵敏度也降低了65%，且其回收率表现异常（远大于120%），表明10%乙腈溶液已破坏两个蛋白质构象，降低了金标抗体的生物活性，且其对GNP@mAbL005的破坏性更为严重。当直接稀释倍数升至20 倍甚至40 倍，即分别含有体积分数5%及2.5%乙腈时，两个抗体也表现出对有机溶剂不同的抵抗力，其中GNP@NbFM5的回收率为91.5%以及119.7%，均比吹干复溶稀释相同倍数后的回收率高，而GNP@mAbL005则出现相反的结果，表明NbFM5偶联GNP后，其有机溶剂耐受性能优于mAbL005且在低浓度有机溶剂条件下的灵敏度仍可满足检测需求。综合情况下，mAbL005体系采用吹干复溶的前处理方法，而NbFM5体系则省去此步骤直接稀释进行检测，其中稀释20 倍以上的标准曲线与缓冲液基本重合，因此以含有5%乙腈、pH 7.4的0.1 mol/L PB作为药物稀释液对NbFM5试纸条进行方法的评估。

4 试纸条性能评价

灵敏度

在上述的最佳条件下，其检出限（IC10）、半抑制浓度（IC50）以及检测线性范围（IC20～IC80）分别为0.44、6.29 μg/L和1.71～23.05 μg/L（图8a）。图8b显示了GNP@NbFM5-GICA在不同质量浓度PRM下的试纸条效果，随着PRM质量浓度从0 μg/L增加到5000 μg/L，检测线上的红带从强变弱，vLOD为200 μg/L。为了进行比较，在最优条件下还进行GNP@mAbL005-GICA的曲线拟合，结果表明其IC10、IC50、vLOD及线性范围分别为1.56、32.15、1000 μg/L和9.51～108.64 μg/L。与之相比，GNP@NbFM5-GICA的灵敏度提高了4.1 倍。上述结果表明，GNP@NbFM5-GICA的灵敏度优于GNP@mAbL005-GICA，由于PRM的国标限量为200 μg/L，因此前者可不借助仪器设备，直接用裸眼进行定性判断。

特异性

通过分析比较PRM的代谢物（3,5-二氯苯胺）及其结构与功能的类似物（菌核净、异菌脲、乙烯菌核利、灭菌丹、乙菌利、百菌清、克百威、多菌灵）试纸条显色情况分别评估GNP@mAbL005-GICA、GNP@NbFM5-GICA方法的特异性。如图9所示，GNP@NbFM5-GICA对质量浓度为20 μg/L的PRM显示强阳性，而对其他类似物及代谢物（20 mg/L）均为阴性，但是GNP@mAbL005-GICA对20 mg/L的核菌净也显示出强阳性，表明本研究建立的GNP@NbFM5-GICA法的特异性较高且优于基于mAb的GICA法，可用于PRM的特异性检测。

准确性

1 样品添加回收

用GNP@NbFM5-GICA法对添加不同含量PRM的空白韭菜、黄瓜及番茄样品进行检测，通过回收率和变异系数分别对其准确性和精密度进行评估。如表3所示，3 种样品的添加回收率在80.1%～109.6%之间，变异系数小于11%，可接受的回收率以及变异系数表明GNP@NbFM5-GICA可以满足实际样品中PRM的检测需求。

2 仪器验证

分别采用本研究新建立的GNP@NbFM5-CICA与气相色谱-质谱联用法对韭菜、黄瓜、番茄各5 份盲样进行检测。如表4所示，其中黄瓜及番茄各1 份未检出PRM，其余13 份盲样的两种检测方法结果无显著差异，说明本研究所建立的免疫层析检测方法具有良好的准确性。

试纸条稳定性

为验证试纸条的稳定性和再现性，在45 ℃条件下进行加速稳定性实验。图10表明，两种GICA的灵敏度都随着加速实验的进行先下降后上升，其中GNP@mAbL005-GICA从第14天显色强度明显下降，21 d后试纸条基本失效。与之相比，GNP@NbFM5-GICA在28 d后其显色强度才表现出明显的下降，表明GNP@NbFM5-GICA具有更高的储存稳定性，其货架期更长，更有利于开发。

5 结论

基于Nb的高亲和力、高稳定性、低生产成本、易改造等特性，本研究以此抗体建立了针对小分子农药PRM的胶体金免疫层析检测方法。在优化过程中建立了一套适用于将抗PRM-Nb应用于GICA的稳定体系，使用小粒径GNP在抗体pI附近的pH值条件下对适量Nb进行标记可以使其探针GNP@Nb达到最佳的结合效率与稳定性，当其检测缓冲液的pH值过低以及离子浓度过高会通过影响探针的稳定性对试纸条的显色效果造成负面影响，但是该体系是否具有普遍性还待继续使用其他Nb进行进一步的验证。与基于抗PRM-mAb的GICA法相比，该法具有更低的生产成本、更简单的前处理程序、更高的灵敏度与特异性以及更长的货架期，适用于现场PRM的检测。鉴于Nb易于进行基因改造的特性，还可以进行其他功能化分子的融合以及多价抗体的制备，为其应用于GICA提供更多灵活的策略。

本文《基于纳米抗体的胶体金免疫层析法快速检测蔬菜中腐霉利》来源于《食品科学》2023年44卷08期307-316页。作者：何晓婷，陈子键，黄松，肖泽苗，刘佳，钟敏，王弘，沈玉栋，徐振林. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220218-143. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：彭凯雄. 责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。

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