双孢蘑菇（Agaricus bisporus）又名白蘑菇，是世界上种植和消费最广泛的食用菌，占每年食用菌总量的10%。双孢蘑菇不仅味道鲜美，而且具有丰富的营养和药用价值。蘑菇采后褐变是一个复杂的化学过程，其中酶促褐变主要归因于多酚氧化酶（PPO）的作用。PPO有膜结合态（mPPO）和可溶态（sPPO）两种存在形式，二者在分离纯化和酶活力等方面不一致。PPO的合成和运输是一个复杂的过程，mPPO的高活力对果蔬在成熟和衰老过程发生酶促褐变的程度可能具有较大影响。
天津商业大学生物技术与食品科学学院的何兴兴，关文强*和陕西宏梁食品科技有限公司的雷静通过粗酶提取、不同饱和度硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子交换柱层析对双孢蘑菇的sPPO和mPPO进行初步分离纯化和基本酶学性质的研究，旨在开发一种双孢蘑菇两种不同形态PPO的提取纯化方法，为其他真菌类蔬菜PPO分离纯化提供一定的方法借鉴，也为开发抑制双孢蘑菇酶促褐变的技术提供理论基础。
1 蛋白含量标准曲线
以牛血清蛋白作为标准物进行标准曲线制作。由该曲线线性拟合求得线性回归方程为Y=5.867 1X＋0.000 5，R²=0.999 1。说明本曲线在蛋白质量浓度0.0～1.0 mg/mL范围内有良好的线性关系。
2 硫酸铵分级沉淀饱和度的确定
如图1所示，sPPO与mPPO均在硫酸铵饱和度为30%～70%时沉淀出的蛋白较多，显著高于在硫酸铵饱和度为20%和80%时所沉淀出的蛋白质量（P＜0.05）。对于sPPO溶液，当硫酸铵饱和度从20%上升到60%时，沉淀中的sPPO比活力随硫酸铵饱和度增加逐渐上升，直到达到最大值4 098.93 U/mg。当硫酸铵饱和度为4 0%～7 0%时，所沉淀出蛋白中的sPPO比活力显著高于20%～30%以及80%饱和度（P＜0.05），因此选取40%～70%饱和度进行sPPO的盐析。mPPO溶液在硫酸铵饱和度为30%～40%时，沉淀出的大多为杂蛋白（mPPO比活力较低），当硫酸铵饱和度为50%～80%时，mPPO溶液中沉淀出的蛋白中PPO比活力显著高于20%～40%饱和度（P＜0.05），说明目标酶被沉淀纯化析出。为了使PPO活力得到最大的回收，同时纯化出较多的PPO蛋白，所以选取50%～80%饱和度进行mPPO的盐析。
3 DEAE琼脂糖快速流动阴离子交换柱层析
如图2所示，在进行sPPO和mPPO柱层析时，使用0～0.5 mol/L的NaCl洗脱液进行洗脱过程中，每个洗脱梯度均出现不同程度的蛋白峰，且蛋白峰的高度随NaCl浓度的增加逐渐减小，当NaCl浓度为0 mol/L洗脱时，sPPO和mPPO粗酶液中洗脱下来的蛋白吸收峰均最大，但相应的酶活力都很小，说明不含NaCl的洗脱液能将sPPO和mPPO蛋白溶液中的杂蛋白物质洗脱下来。当NaCl浓度增加至0.3 mol/L（30～40 管）时，sPPO和mPPO均出现最高酶活峰，分别为1 368 U/（mL·min）和576 U/（mL·min），且sPPO在31～35 管酶活最高，mPPO在31～33 管酶活力最高。而当NaCl浓度大于0.3 mol/L时，sPPO和mPPO洗脱下来的蛋白溶液所对应的酶活力均较低，说明此时所洗脱下来的蛋白质溶液均为杂蛋白。因此，将最高酶活力管进行合并，超滤浓缩后封存于20%甘油中于－30 ℃保存备用。
4 纯化结果分析
双孢蘑菇中的sPPO和mPPO在经硫酸铵沉淀、DEAESepharose Fast Flow柱层析分离纯化后其目标酶的回收率和纯化倍数如表3所示。双孢蘑菇sPPO和mPPO经逐步纯化后，总蛋白均明显下降，比活力明显提高。其中，sPPO经纯化后的最终目标蛋白质量为2.64 mg/mL，相比于粗蛋白溶液，酶比活力提高到12.20 倍，最终的酶比活力为6 912.88 U/mg。而mPPO在经50%～80%硫酸铵沉淀后，去除了41.34%杂蛋白，酶比活力提高到1.33 倍，经DEAE阴离子交换柱纯化后，酶比活力提高到19 092.94 U/mg，远高于sPPO的比活力，而相比于mPPO粗蛋白溶液，酶的比活力提高到10.86 倍，且纯化后的mPPO比活力高于蛇果（比活力为15.16 U/mg）、茄子（4 925 U/mg）、枇杷（91.5 U/mg）等。
5 PPO纯度和相对分子质量
为了确定纯化的效果，对sPPO和mPPO的粗酶液和纯化液进行SDS-PAGE和Native-PAGE，结果如图3所示。SDS-PAGE中使用的SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理蛋白质变性（肽链伸展），将多亚基的蛋白质解离为单亚基，并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物。mPPO粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析等纯化方法后呈现两条较为清晰的蛋白条带。基于SDSPAGE的实验原理，这个结果有两种可能，一种是mPPO未纯化完全，纯化液中有两个蛋白，分子质量分别约为11 kDa和25 kDa；一种是mPPO纯化完全，这两条条带是同一个蛋白上解离出来的亚基，mPPO的分子质量约为二者之和。而mPPO经纯化后的Native-PAGE呈现单一同工酶条带，验证了mPPO的SDS-PAGE中显示的两条条带为同一个蛋白上的两个亚基，mPPO的分子质量至少为36 kDa。文献报道显示植物中PPO的分子质量多种多样，本研究得到mPPO的分子质量低于其他植物mPPO，如茄子、桃、蛇果，分子质量分别为65、59.2 kDa和38 kDa，这可能是由于PPO在分离纯化过程中部分蛋白被水解的原因。该结果表明mPPO经硫酸铵沉淀、柱层析等手段可得到有效纯化。
而sPPO粗酶液经纯化后得到的SDS-PAGE呈现3 条较为清晰的蛋白条带，分子质量从大到小依次为56、25 kDa和11 kDa，其Native-PAGE显示了4 条颜色较深的同工酶条带，除分子质量较小的3 个同工酶条带外，出现了同mPPO相同的较大同工酶条带。且Native-PAGE蛋白条带个数（4 条）大于SDS-PAGE中显示的3 条条带，说明sPPO的某种同工酶可能为某种相同亚基的同聚酶。但目前尚未看到关于双孢蘑菇PPO蛋白聚集形态方面的报道。该结果也表明sPPO未得到有效纯化，分析原因可能是因为提取粗蛋白匀浆过程中将轻微结合于膜上的PPO被分离出来，后面的纯化过程不足以将其分离出来。由于本研究重点探讨sPPO和mPPO的分离纯化方法及其基本酶学性质，因此没有进一步对纯化的PPO进行质谱等分子鉴定。
6 mPPO和sPPO的酶促动力学
sPPO和mPPO对底物邻苯二酚的酶促动力学曲线结果如图4所示，从拟合的Michaelis-Menten函数得出，sPPO的Km为8.85 mmol/L，Vmax为1 196 U/（mL·min），mPPO的Km为5.07 mmol/L，Vmax为3 120 U/（mL·min）。由此可知，mPPO跟邻苯二酚结合能力更强，褐变反应速度更快。这些结果说明PPO与某一底物间的亲和力与催化活性可能与酶源及同工酶构成有关。
7 温度对sPPO和mPPO活力的影响
从图5可以看出，sPPO和mPPO比活力先随温度升高而上升，均在30 ℃时达到最大值，然后随温度的继续升高而下降，表明sPPO和mPPO的最适反应温度均为30 ℃，该结果与大多数植物PPO的最适温度一致。此外，在低于20 ℃，高于45 ℃时，PPO活力较小。当反应温度升高到70 ℃时，sPPO和mPPO均不表现出明显活力。这是由于PPO在最适温度才能被完全激活，低温处理会抑制酶活力，但不致使其失去活力，而高温使蛋白变性而使酶失活。因此，在双孢蘑菇的酶促褐变控制方面通常采用低温贮藏抑制PPO的活力，从而延缓双孢蘑菇的褐变。
8 pH值对sPPO和mPPO活力的影响
如图6所示，sPPO和mPPO在pH 3.0～8.0之间活力均呈现先上升后下降的变化趋势，最适pH值均为6.8。在小于pH 4.0或大于pH 7.5时，PPO的催化活性显著下降。这是因为PPO含辅助因子Cu2＋，Cu2＋在强酸性环境中会被解离出来，使酶失活。而在强碱条件下，Cu2＋会与溶液中OH·反应生成Cu(OH)2，也会造成酶失活。因此，通过调节pH值可有效抑制双孢蘑菇PPO的活力。该结果与已报道的双孢蘑菇的PPO最适pH值相近。
9 底物对sPPO和mPPO活力的影响
从表4可以看出，sPPO和mPPO对含不同羟基个数的多酚底物的催化活性差异很大，且sPPO和mPPO均对邻苯二酚的催化活性最高。实际上，果蔬的褐变程度与总酚含量关系更为密切而非取决于某种单一的多酚含量。不同的酶具有不同的最适底物。刘芳调研发现不同来源、不同种类植物果实的PPO最适底物差异较大，而同一种类植物果实在不同的生长发育阶段，其PPO最适底物也存在差异，且PPO不一定与其最适天然底物存在于同一植物体中。
结论
对双孢蘑菇的sPPO和mPPO进行了纯化和分析，最终分别得到纯化倍数为12.20和10.86、比活力为6 912.88 U/mg和19 092.94 U/mg、蛋白得率为17.77%和10.72%的sPPO和mPPO酶液。经SDS-PAGE和NativePAGE检验，所得到的mPPO呈单一蛋白带，表明本研究所建立的方法能使mPPO得到有效纯化。而所得sPPO未得到完全纯化，还需进行下一步柱层析纯化得到高纯度的sPPO。当以邻苯二酚为底物时，sPPO的米氏常数Km为8.85 mmol/L，Vmax为1 196 U/（mL·min），而mPPO的Km为5.07 mmol/L，Vmax为3 120 U/（mL·min），且双孢蘑菇中的mPPO比sPPO呈现更高的催化活性。sPPO和mPPO对邻苯二酚的最适反应温度和pH值分别为30 ℃和pH 6.8。本研究通过探究双孢蘑菇中sPPO和mPPO的提取纯化方法，为下一步研究双孢蘑菇贮存及加工过程中酶促褐变控制技术奠定基础。
本文《可溶态和膜结合态双孢蘑菇多酚氧化酶的分离和纯化及酶特性分析》来源于《食品科学》2023年44卷第10期173-180页，作者：何兴兴，雷静，关文强。DOI :10.7506/spkx1002-6630-20220609-094 。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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