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Introduction

牡蛎（Crassostrea gigas）有着悠久的农业历史，并且其富含蛋白质、维生素、矿物质和脂肪酸，由于其对鲜味的突出贡献，其也是蚝油的重要成分。贝类的鲜味主要来源于的鲜味化合物，如天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、琥珀酸、琥珀酸酯、肌苷酸（IMP）、磷酸鸟苷（GMP）和鲜味肽。一般来说，鲜味肽可以被添加到调味品中，以提高食品的适口性，同时减少氯化钠的添加量。尽管人们对研究海洋来源的鲜味肽越来越感兴趣，但从牡蛎中鉴定鲜味肽的工作却很少。

超滤、凝胶色谱和反相高效液相色谱传统上用于提取鲜味肽。然而，这些步骤既费力又繁琐。使用计算机算法预测肽的活性已经变得越来越流行。虚拟筛选具有高效、快速的特点，常被用于协助筛选鲜味肽。iUmami-SCM是一种计算机算法，用于根据序列信息预测肽的鲜味，如疏水性、分子量和氨基酸酸度。

味觉受体T1R1/T1R3异二聚体通常被认为是主要的umami受体。由于未充分研究umami受体的结构和功能，其晶体结构尚未确定，因此通过计算机模拟分析的技术也非常可靠。位于T1R3中的VFTD有一个大的结合腔，被认为是一个能够结合鲜味肽的配体结合结构域。同源模型可以用来建立可靠的T1R1/T1R3分子对接受体模型。此外，通过分析结合能和活性位点，分子对接技术是研究鲜味肽与鲜味受体T1R1/T1 R3异二聚体之间作用机制的有效方法。

大连工业大学杜明教授、大连工业大学付柏枫硕士 在本研究中利用一种快速有效的虚拟筛选方法，从牡蛎中鉴定潜在的鲜味肽，并且预测和筛选其鲜味贡献。应用nano-HPLC-MS/M技术鉴定潜在肽。为了快速有效地从已鉴定的肽中筛选出鲜味肽，应用了iUmami-SCM网站和分子对接。为了验证肽的鲜味强度，使用了感官评估和电子舌。然后我们通过同源建模和分子对接分析了鲜味肽与鲜味受体T1R1/T1R3的结合机制。

Results and Discussion

牡蛎分离组分味道的测定

图1显示了牡蛎分离组分的感官评估和电子舌测试结果。如图1所示，OY-W和0%-E这两个组分在酸味、甜味、咸味、苦味和鲜味方面表现出相似的总体味道。这可能是因为OY-W中的大多数物质都是水溶性的，分析。根据电子舌测试结果（图1B），与OY-W和0%-E相比，100%-E馏分的鲜味、咸味和苦味更浓，但远弱于20%-E（1.50）（图1B）。由于20%-E组分显示出最强的鲜味潜力，因此将其收集并冷冻干燥以挖掘鲜味肽。

鲜味肽的鉴定与预测

使用nano-HPLC-MS/MS，从20%-E中鉴定出2744个肽。其中，1262个S(P）具有值的肽大于588.00，通过iUmami SCM算法评分，S(P）≥588.00被判定为umami肽。因此，选择了13个S(P）得分最高的短肽进行分子对接（表1）。他们分别是FLNQDEEAR、FNKEE、FSSVTLST、EEFLK、AVTTL、TLLT、LSWV、LSYF、LSFY、VPDGDLS、IWT、LWT和LSPL。

在13种肽中，FLNQDEEAR表现出最高的“-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY”，其次是FSSVTLST、FNKEE和EEFLK。LWT的能量最低（55.5169 kcal/mol）。然而，与其他长度较短的肽相比，FLNQDEEAR肽和FSSVTLST肽的-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY较高。这可能是因为这两种肽具有适当的氨基酸数目，可以缩短与umami受体的对接距离。基于iUmami-SCM和分子对接的结果，选择并合成了三种肽FLNQDEEAR、FNKEE和EEFLK，这三种肽在肽链的不同位置有两个谷氨酸残基，以进一步验证它们的味道特征及其与鲜味受体的相互作用，初步探讨肽结构与鲜味强度之间的潜在机制。

表1 鲜味肽与T1R1/T1R3的分子对接能量及iUmami-SCM网站评分

鲜味肽味道的测定

合成肽的感官评估和电子舌分析结果如图3所示。如图3A和B所示，肽FE-5比EK-5具有更强的鲜味，这可能是由于谷氨酸残留在肽FE-5的C末端。对于肽FR-9，其鲜味最低，但苦味最强，可能是因为苦味掩盖了其鲜味。此外，FR-9的谷氨酸位于肽链的中间，这可能导致鲜味低于FE-5和EK-5。三种肽的鲜味阈值如表2所示。肽FE-5、EK-5和FR-9的鲜味阈分别为0.38、0.55和0.58 mg/mL。

表2 三种鲜味肽的鲜味阈值及感官描述

鲜味多肽与T1R1/T1R3的计算分子对接

图4A-C显示了分子对接的2D图，包括与鲜味受体对接的最佳对接姿势和对接位置。图4D给出了鲜味肽的受体结合位点。如图4所示，三种鲜味肽与T1R3亚基VFTD的结合位点包括Arg591、Phe592、Gly695、Gln853、His915、Pro968、Arg712和Pro715。这三种肽都可以与Gln852和Phe593结合位点结合，所以认为其是最关键的结合位点。一些学者认为，当它们含有一个或两个酸性氨基酸（Asp和Glu）时，鲜味肽更有可能与鲜味受体T1R1/T1R3结合。本研究发现，鲜味肽与T1R3亚基之间的结合力主要是氢键、静电相互作用、范德瓦尔斯力和疏水相互作用。本研究中氢键最多，其次是静电相互作用，其中盐桥是一个重要的键。

味觉评分最高的肽FE-5的C端由两个Glu酸基团组成，它们与Phe592、Arg712和His915形成强烈的盐桥，而N端Asn可以与Gln853和Thr713形成氢键。

与FE-5相反，EK-5的N端是两个Glu残基，其味觉评分低于FE-5，分别与Ser697、Pro715和Gly695形成氢键。值得一提的是，末端Glu与Glu828和Asp717形成了不利的相互作用。这可能是EK-5味道不如FE-5的原因。有趣的是，在EK-5的C末端发现了氨基酸残基Lys，并通过盐桥强烈粘附到结合位点Arg591。对于鲜味评分最低的肽FR-9，其C端氨基酸残基Arg与Arg591建立了盐桥，其中间Glu残基与Typ599和Phe592形成氢键。

Conclusion

从太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）中鉴定出三种新的鲜味肽FLNQDEEAR、FNKEE和EEFLK。通过感官分析、电子舌测试和分子对接研究了它们的味觉特征及其与鲜味受体的潜在相互作用。鲜味肽末端有两个谷氨酸残基的肽比中间有两个Glu残基的多肽具有更强的鲜味。此外，需要更多的研究来揭示肽结构和鲜味强度之间的关系。

第一作者

付柏枫，女，现为大连工业大学食品学院/国家海洋工程技术研究中心2020级硕士。研究方向：食源性蛋白肽的构效关系及风味特性。

通信作者

杜明，男，大连工业大学食品学院教授，博士生导师，大连工业大学朱蓓薇院士团队“蛋白质科学与技术”研究方向负责人。国家万人计划科技创新领军人才、科技部中青年科技创新领军人才、教育部新世纪优秀人才支持计划、兴辽计划领军人才（辽宁省特聘教授）、辽宁省优秀专家、省农业创新团队首席、辽宁省“百千万人才工程”(百人层次)、大连市杰出青年科技人才等荣誉称号。兼任中国食品科学技术学会青年委员会委员、中国畜产品加工研究会常务理事、中国农学会农产品贮藏加工分会理事、中国营养学会骨营养与健康专业委员会副主任等职务；学术兼职包括eFood共同主编（ISSN: 2666-3066）、Food Science and Human Wellness、Protein and Peptide Letters、《食品科学》、《食品工业科技》、《大连工业大学学报》等期刊编委。主要从事的研究领域：（1）食源性蛋白肽构效关系及活性机制；（2）专用功能性蛋白质配料加工技术；（3）民族特色食品加工及产业化。主持国家十三五重点研发专项项目、国家十四五重点研发专项项目、国家自然科学基金重点项目等各类科研课题30余项。在Biotechnol. Adv.等期刊以第一或通讯身份发表SCI收录论文百余篇, ESI高被引文章2 篇（Food Chemistry等）；主编或参编Springer等出版著作《Mineral Containing Proteins》、《Biologically Active Peptides》等13 部，第一发明人授权国家发明专利11 项。

Three novel umami peptides derived from the alcohol extract of the Pacific oyster (Crassostrea gigas): identification, characterizations and interactions with T1R1/T1R3 taste receptors

Baifeng Fua,b, Di Wua,c, Shuzhen Chenga,b,c, Xianbing Xua,b,c, Ling Zhanga,c, Lishu Wangd, Heshanm R. El-Seedie, Hanxiong Liua,c, Ming Dua,b,c,*

a College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

b Beijing Key Laboratory of Plant Resource Research and Development, BeijingTechnology and Business University, Beijing 100048, China

c Department of Breast Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Oyster (Crassostrea gigas), the main ingredient of oyster sauce, has a strong umami taste. In this study, three potential umami peptides, FLNQDEEAR (FR-9), FNKEE (FE-5), and EEFLK (EK-5), were identified and screened from the alcoholic extracts of the oyster using nano-HPLC-MS/MS analysis, iUmami-Scoring Card Method (iUmami-SCM) database and molecular docking (MD). Sensory evaluation and electronic tongue analysis were further used to confirm their tastes. The threshold of the three peptides ranged from 0.38 to 0.55 mg/mL. MD with umami receptors T1R1/T1R3 indicated that the electrostatic interaction and hydrogen bond interaction were the main forces involved. Besides, the Phe592 and Gln853 of T1R3 were the primary docking site for MD and played an important role in umami intensity. Peptides with two Glu residues at the terminus had stronger umami, especially at the C-terminus. These results contribute to the understanding of umami peptides in oysters and the interaction mechanism between umami peptides and umami receptors.

Reference:

FU B F, WU D, CHENG S Z, et al. Three novel umami peptides derived from the alcohol extract of the Pacific oyster (Crassostrea gigas): identification, characterizations and interactions with T1R1/T1R3 taste receptors[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(1): 146-153. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250012.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

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