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Introduction

膳食多酚被认为具有抗氧化、抗炎、抗菌等活性，长期摄入富含黄烷-3-醇的食物或提取物能降低慢性疾病，包括心血管疾病（CVD）、II型糖尿病和肥胖的发病率。但包含原花青素、姜黄素、茶多酚在内的许多膳食多酚在胃肠道的吸收并不理想，很难达到其发挥各类活性的有效剂量。近年来的研究发现，肠道微生物能够代谢在小肠中未吸收的膳食多酚，产生的小分子酚类代谢物可以通过肠壁吸收进入宿主体内。Colin D. Kay等在2017年提出，如果将肠道微生物代谢膳食多酚产生的低分子量酚类化合物考虑进去，多酚类物质的生物利用率将远高于之前的认知。

一些小分子酚类代谢物在体内循环系统中的浓度远高于母体化合物，并且具有与母体化合物相似或者更高的生理活性。例如原花青素A2的代谢物3-(4ʹ-羟基)苯丙酸可以通过调节细胞脂质代谢，抑制细胞氧化应激和炎症，抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化。原花青素的肠道代谢物如4-羟基马尿酸、3-(3ʹ,4ʹ-二羟基)苯丙酸和3,4-二羟基苯乙酸都能显著抑制脂多糖刺激外周血单核细胞的TNF-α的分泌。2,3-二羟基苯甲酸调节大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E Cell）对葡萄糖吸收和产生，改善胰岛素信号传导。5-(3,5-二羟基苯)-γ-戊内酯能够穿透血脑屏障（BBB）并增殖神经节癌细胞（SH-SY5Y Cell）。3,4-二羟基苯乙酸通过调节NOX-4/SIRT-1信号来保护肾近端管状细胞免受高葡萄糖诱导氧化应激的影响。

但以上对于黄烷-3-醇的代谢产物的活性研究都基于体外细胞模型，目前较少研究考察代谢产物在生物体内作用效果及机制。华中农业大学食品科学技术学院刘睿教授以多种膳食多酚经肠道微生物代谢后普遍产生的代谢物，3,4-二羟基苯乙酸（DHAA）和3,4-二羟基苯丙酸（DHPA）为材料，通过口服给予高脂饮食（HFD）小鼠低剂量（接近于膳食多酚转化剂量）的DHAA和DHPA，研究这两种代谢物对肥胖及胰岛素抵抗的影响，并通过肠道微生物多样性分析和尿液代谢组学研究其发挥作用的路径和机制，揭示膳食多酚的肠道微生物代谢物在调解肥胖中的重要作用。

Results and discussion

DHAA和DHPA对高脂饮食小鼠生理生化的影响

在DHPA和DHAA组小鼠的日摄食量和卡路里摄入量组与高脂饮食组（M组）相近的情况下(图1A&B)，DHPA组和DHAA组体重低于M组（图1C，P< 0.05），空腹血糖、餐后血糖和胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）也均低于M组（图1D-G，P < 0.05）。显然，这两种代谢物具有减重和调节血糖、抵抗胰岛素抵抗的作用。此外，DHPA和DHAA组肝脏TC含量显著低于M组（图1I，P < 0.05），但TG水平无显著差异（图1H）。进一步分析肝脏的氧化应激水平， DHPA组MDA水平显著低于M组（图1J）， DHAA组SOD活性显著高于M组（图1K，P< 0.05）。而DHPA组和DHAA组GSH水平与M组无明显差异（图1L）。说明DHPA和DHAA能够稍微缓解脂肪在肝脏的积累和氧化应激损伤。

肝脏和附睾脂肪组织切片也同样能够证明DHPA和DHAA在减脂和保护肝脏脂肪变性方面的作用。M组的肝脏组织切片中微泡性脂肪堆积，而DHPA和DHAA的干预明显缓解了这些组织学改变，甚至导致脂肪液泡消失（图2A）。脂肪组织切片组织学和定量分析显示，DHAA组和DHPA组附睾脂肪细胞大小与正常饮食组（N组）相近，显著小于M组（图2 B&C，P< 0.05）。

图1 DHPA和DHAA对高脂饮食小鼠生理生化的影响

图2 肝脏（A）和附睾脂肪（B）组织切片和脂肪细胞大小（C）

DHAA和DHPA对高脂饮食小鼠肠道微生物的影响

主坐标分析（PCoA）显示M组与N组明显分离，而DHPA组和DHAA组的点聚集在一起，且与M组相近（图3A），说明DHPA或DHAA均不能改善粪便菌群。为了确定肠道微生物中是否发生了结构变化，比较了四组中确定的优势类群的相对比例。结果表明，N组以厚壁菌门为优势门，其次为拟杆菌门；而在M组Firmicutes和Actinobacteria的相对丰度显著高于N组，而Bacteroidetes的相对丰度显著低于N组。但DHPA和DHAA处理后，两组与M组相比，微生物组成和比例无显著差异（图3B）。

厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)比值在以前的研究中被认为是评估糖尿病和肥胖风险的重要指标，因此，作者计算了所有组的F/B比。与PcoA的结果一致，M组的F/B比高于N组，但与DHPA和DHAA组无显著差异（图3C）。HFD对能够反映肠道菌群多样性的Simpson指数和Shannon指数影响较弱，而摄入DHPA和DHAA也没有导致这些指标发生变化（图3D）。肠道菌群在属水平的热图分析显示，M组相对于N组具有明显的微生物分布差异，HFD主要诱导Roseburi、Bilophila、Oscillibacter和Ruminiclostriduim的增加。然而，DHPA和DHAA灌胃16周并没有导致微生物组成发生太大变化，只有DHPA轻微改变了Akkermansia的丰度(图3E)。

图3 小鼠粪便微生物多样性分析

作者进一步用UHPLC-Q-TOF/MS分析小鼠尿液和盲肠内容物中DHPA和DHAA及其Ⅱ相反应物的水平。结果发现，尿液中DHPA或DHAA的原型低级，但含有较高水平的硫酸盐Ⅱ相反应物（图4a&C）。在盲肠内容物中， DHPA或DHAA的原型和其硫酸盐Ⅱ相反应物都极低（图4 B&D）。因此，可以推测DHPA或DHAA可能在小肠中几乎完全被吸收，极少量进入到结肠中，因此对肠道菌群的影响较小。

图4 小鼠尿液和盲肠内容物中DHPA和DHAA及其Ⅱ相反应物的水平

DHAA和DHPA对对高脂饮食小鼠尿液代谢组的影响

采用UHPLC-Q-TOF/MS分析小鼠尿液的代谢组学特征，筛选各组间的差异代谢物。PCA结果显示（图5A），M组和N组完全分离，DHPA组和DHAA组的尿液代谢模式与M组有显著差异。此外，DHPA和DHAA两组的尿代谢组谱有很大的重叠，说明这两种化合物都可以改变HFD喂养小鼠的代谢，并可能通过相似的机制影响代谢过程。图5C的热图显示了四组间的差异代谢物，结果与PCA结果一致。这些结果证实了DHPA和DHAA可以改变HFD喂养小鼠的代谢，使其恢复到接近N组的水平。

共鉴定出54个差异代谢物，并将潜在的生物标志物导入MetaboAnalyst数据库进行通路分析(图5B)。结果表明，DHPA和DHAA主要通过戊糖与葡萄糖酸盐相互转化、酪氨酸代谢、磷酸戊糖与三羧酸(TCA)循环4个途径缓解肥胖。此外，DHPA和DHAA组也有其独特的代谢物。DHPA的摄入诱导了高香草酸硫酸盐、4-HPAA-硫酸盐、DHPA-硫酸盐、甲基-DHPA-硫酸盐、4-乙酰丁酸和4-HPAA硫酸盐的生成。DHAA促进DHAA硫酸酯、小茴香酸和3-HPAA硫酸酯的生成。

图5 小鼠尿液代谢组学分析

小鼠肠道微生物组与尿液代谢组相关性分析

对小鼠肠道微生物组与尿液代谢组进行相关性分析。拟杆菌属、Odoribacter和Muribaculum与尿液中的差异代谢物有较强的相关性（图6）。尿液中的脂肪酸及其代谢物与不同的细菌类群有较强的相关性，如天龙骨酸、辛酸、戊酸、乙酰丙酸、癸二酸、4-羟基丁糖酸。但与DHPA和DHAA对肠道菌群影响不大的结果一致，DHPA和DHAA代谢物与肠道菌群的相关性也较弱。

图6 小鼠肠道微生物组与尿液代谢组相关性分析

将尿液中的代谢物与代谢表型进行相关性分析，包括体质量、OGTT曲线下面积(AUC)、空腹胰岛素、TG、TC、MDA、GSH和肝脏中的SOD（图7）。结果表明，尿液代谢组的变化与体重、SOD水平有较强的相关性。琥珀酸、4-羟基丁烯酸、2-乙基丁基乙酯与血浆中OGTT和空腹胰岛素水平呈负相关。2-乙基乙酸丁酯与肝脏TC水平呈负相关。4-羟基丁烯酸与肝脏中MDA水平呈负相关2-乙基乙酸丁酯与SOD活性呈正相关。甲硫酰丁酸与体重、空腹胰岛素水平呈正相关。DHPA和DHAA可能通过影响这些代谢物发挥减脂作用。

图7 尿液中的差异代谢物与代谢表型相关性分析

Conclusion

综上所述，膳食多酚的肠道微生物代谢物DHPA或DHAA可缓解HFD引起的体重增加、氧化应激失衡和糖脂代谢紊乱。虽然膳食中补充DHPA或DHAA并没有逆转HFD引起的肠道微生物群落结构紊乱，但却导致了代谢的显著变化。说明，DHPA或DHAA有可能通过直接影响酪氨酸代谢和戊糖与葡萄糖酸盐的相互转化等代谢途径缓解HFD诱导代谢综合征。

第一作者简介

陈婉冰，女，博士。毕业于华中农业大学食品科学技术学院，现任广东省农业科学院果树研究所助理研究员。天然产物与分子营养方向，主攻食物多酚与肠道微生物的相互作用，植物多酚的功能性食品开发。发表SCI/EI收录的论文8 篇，第一作者发表SCI论文2 篇。

刘若男，女，硕士。毕业于华中农业大学食品科学技术学院，研究方向为功能食品与分子营养。以第一作者在EI收录期刊上发表论文3 篇。

通信作者简介

刘睿，男，博士。华中农业大学食品科学技术学院教授、博士生导师，武汉市“黄鹤英才”，武汉市现代都市农业产业技术体系岗位专家。现任农业农村部蜂产品质量安全控制重点实验室学术委员会委员，中国养蜂学会蜂产品专业委员会副主任、湖北省养蜂学会常务副理事长、武汉市蜂产品质量工程控制技术研究中心主任。农业农村部“华中都市农业重点实验室”、国家发改委“稻谷及副产物深加工国家工程中心（武汉）”和教育部“环境食品学重点实验室”固定研究人员。主要在“特色农（含蜂）产品精深加工与高值化利用”和“膳食多酚与分子营养”等领域开展研究。采用广泛靶向代谢组学和非靶向代谢组学等技术解析黄烷醇类膳食多酚与肠道微生物的互作机制，筛选到参与黄烷醇膳食多酚C-环开环代谢特定肠道微生物；开展了膳食多酚等对糖脂代谢、肥胖、动脉粥样硬化、结肠炎、酒精性肝损伤、尿路感染和前列腺病变的调控机制研究；探讨了膳食多酚对食品热加工过程中新生污染物及其诱导肠道屏障损伤的干预机制；解析究了黑米中营养成分在烹饪加工中的代谢网络，并评估了其调节糖脂代谢的效果。采用代谢组学技术和合成生物学思路研究了益生菌对蜂产品的转化与增效机制。主持国家自然科学基金面上项目3项、国家“十四五”重点研发计划子课题、湖北省重点研发计划、湖北洪山实验室重大项目子项目、国家质检总局公益性行业专项子项目、湖北省科技成果转化资金项目、武汉市科技攻关、武汉市应用基础前沿项目、武汉市农委科研项目、武汉市农科院重大创新项目子项目、恩施州创新团队和企业横向项目等各类科研课题共50多项。曾荣获教育部科技进步一等奖和湖北省科技进步二等奖各1项；以及“中国粮油学会第二届全国粮油优秀科技工作者”；“武汉市优秀科技特派员”荣誉称号。在在《Food Chemistry》、《Food & Function》、《Food Research International》、《International Journal of Biological Macromolecules》、《农业工程学报》、《中国粮油学报》、《中国食品学报》、《食品科学》等SCI、EI和CSCD收录期刊上发表研究论文80多篇。申请发明专利20 项，授权发明专利13 项，获批建设地方标准6 项。

Microbial phenolic metabolites 3-(3’,4’-dihydroxyphenyl)propanoic acid and 3’,4’-dihydroxyphenylacetic acid prevent obesity in mice fed high-fat diet

Wanbing Chena,b,c,d,1, Ruonan Liua,b,c,d,1, Xiaoling Zhue, Qun Lua,b,c,d, Hong Yanga,b, Rui Liua,b,c,d,*

a College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430000, China

b Key Laboratory of Environment Correlative Dietology (Huazhong Agricultural University), Ministry of education, Wuhan 430000, China

c Wuhan Engineering Research Center of Bee Products on Quality and Safety Control, Wuhan 430000, China

d Key Laboratory of Urban Agriculture in Central China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430000, China

e Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test, Wuhan 430070, China

1Wanbing Chen and Ruonan Liu contributed equally to this work and are both first author.

*Corresponding author.

Abstract

Obesity is associated with numerous metabolic disorders, and dietary polyphenols have been confirmed to have beneficial effects on the metabolism in obesity. However, the effect of 3-(3’,4’-dihydroxyphenyl)propanoic acid (DHPA) and 3’,4’-dihydroxyphenylacetic acid (DHAA), two main metabolites of dietary polyphenols, on obesity remains poorly understood. In this study, DHPA and DHAA were found to alleviate obesity, as well as regulate insulin resistance, lipid metabolism, and oxidative stress response in high-fat diet (HFD)mice. Surprisingly, the 16S rRNA sequencing and UHPLC-Q-TOF/MS demonstrated that DHPA and DHAA only slightly disturbed the intestinal microbiome, but significantly altered the urine metabolome of HFD mice mainly by regulating pentose and glucuronate interconversion, tyrosine metabolism, pentose phosphate and tricarboxylic acid (TCA) cycle as indicated by metabolic pathway analysis based on Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database. Correlation analysis revealed that the differential metabolites are strongly associated with body weight, blood glucose, insulin level, and superoxide dismutase (SOD) enzyme activity. Our results revealed that DHPA and DHAA exert their anti-obesity effect by regulating important metabolites in the glucose, lipid and tyrosine metabolism pathways.

Reference:

CHEN W B, LIU R N, ZHU X L, et al. Microbial phenolic metabolites 3-(3’,4’-dihydroxyphenyl)propanoic acid and 3’,4’-dihydroxyphenylacetic acid prevent obesity in mice fed high-fat diet[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(1): 327-338. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250027.

文章编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意