Introduction

乳酸菌发酵食品的健康益处逐渐被公众理解和认可。目前，真空冷冻干燥技术是生产益生菌发酵剂最常用的方法。与其他干燥方法相比，冷冻干燥能够去除更多水分，从而延长益生菌粉保质期，降低贮藏的复杂性，便于运输。此外，制得的益生菌粉末具有许多优点，例如高度的多孔性和快速再水化能力。然而，在冻干过程中，益生菌菌株暴露于以干燥和脱水为特征的复杂和极端环境中，可能导致损伤，甚至细胞死亡。因此，增强益生菌菌株对冷冻干燥环境的抗性至关重要。

研究人员发现，与改变冷冻干燥参数或使用冷冻保护剂相比，改变培养条件更具成本效益和效率优势。细菌菌株可以通过自我调节机制适应周围环境的变化，如调节脂肪酸、生物膜和应激蛋白，且这些变化与生长过程中的内部代谢过程直接相关。研究表明，氨基酸具有调节细菌生理代谢的功能。

内蒙古农业大学食品科学与工程学院乳品生物技术与工程教育部重点实验室、农业农村部奶制品加工重点实验室的鄂晶晶等选用植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）LIP-1作为研究对象，评估在生长培养基中添加L-半胱氨酸对菌株冻干存活率的影响。此外，采用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）和基因组学结合实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR），分析和探究L-半胱氨酸影响菌株抗冻干的内在机制。

Results

1 L-半胱氨酸对L. plantarum LIP-1冻干存活率

添加0.05g/L L-半胱氨酸组与未添加L-半胱氨酸组菌株的活细胞数无显著差异。然而，随着L-半胱氨酸添加量增加，菌株的活细胞数呈现下降趋势。与未添加L-半胱氨酸的组相比，当添加0.05g/L L-半胱氨酸时，菌株的冻干存活率显著提高（P＜0.05）。

不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

图1 不同L-半胱氨酸添加量对菌株活细胞（A）和冻干存活率（B）的影响

添加L-半胱氨酸后，各组存活率均显著高于对照组（P＜0.05）。选择L. plantarum LIP-1，并分为2 组进行研究：0.05g/L L-半胱氨酸组（处理组）的冻干存活率较高，而未添加LIP-1组（对照组）的冻干存活率较低。

表1 4 株L. plantarum的活细胞和冻干存活率

2 FTIR分析L. plantarum LIP-1 DNA损伤

与对照组相比，处理组DNA损伤较小，表明L-半胱氨酸对菌株DNA的保护作用与菌株冻干存活率的提高相关。

图2 处理组和对照组DNA损伤FTIR分析

3L. plantarumLIP-1基因组测序

3.1 基因组周期图

通过序列测定，获得了L. plantarum LIP-1基因全长2918140 bp，平均G＋C含量为44.76%。

3.2 COG数据库中的基因注释

共注释了2124 个 L. plantarum LIP-1基因。使用同源蛋白簇（Clusters of Orthologous Groups of proteins，COG）功能模块对L. plantarum LIP-1基因进行分析，将其分为5 类，包括479 个信息存储和加工基因、345 个细胞加工和信号传导基因、895 个代谢基因和405 个具有其他特征的基因。因此，大多数L. plantarum LIP-1功能基因与细胞过程、信号转导和代谢调控有关。

3.3 L-半胱氨酸对ko00270代谢途径的影响

Ko00270途径分析表明，L-半胱氨酸在metC基因的作用下转化为丙酮酸。RT-qPCR结果显示，与对照组相比，处理组metC基因上调1.37 倍（orf 2817，K01760）。

3.4 L-半胱氨酸对细胞内pH值和DNA的影响

处理组的细胞内pH值（4. 92±0. 01）显著高于对照组（4.54±0.01）（ P ＜0.05）。 与对照组相比，处理组 RecA 基因上调1.48 倍。 同时，处理组RecA蛋白合成水平（（13.63±0.45）ng/mL）显著高于对照组（（7.35±0.21）ng/mL）（ P ＜0.05）。

图4 处理组和对照组中的细胞内pH值（A）、基因表达水平（B）以及RecA蛋白含量（C）之间差异

Conclusion

与对照组相比，添加0.05 g/L L -半胱氨酸能够显著提高菌株的冻干存活率。 其机制可能与 L -半胱氨酸上调 metC 基因表达，从而提高细胞内pH值，减轻细胞内DNA损伤有关。 通过对DNA调控能够提高 L. plantarum LIP-1的冻干抗性。

Abstract

Amino acids are often used as probiotic growth factors. Their addition to the growth medium is found to effectively enhance the resistance of the strain to adverse environments. In this research, we found that adding 0.05 g/L L-cysteine to culture medium improved the freeze-drying survival rate of the strain. We investigated the internal mechanism behind this phenomenon and found that the addition of L-cysteine can reduce DNA damage to bacterial cells during the freeze-drying process. In comparison to the control group without L-cysteine, the treatment group with the addition of 0.05 g/L of L-cysteine exhibited an up-regulation of the metC gene, leading to the metabolism of L-cysteine into pyruvate and NH3, which raised the intracellular pH, reduced DNA damage, and consequently enhanced the resistance of Lactiplantibacillus plantarum LIP-1 to freeze-drying.

作者介绍

王俊国 教授

内蒙古农业大学

王俊国，博士、教授、博士研究生导师。主持科研项目包括：1.国家自然科学基金项目（31660456）；2.内蒙古自治区配套中科院西部之光人才培养项目；3.内蒙古自然科学基金项目（2015MS0306）；4.国家自然科学基金项目（31160315）；5.中科院西部之光人才培养项目；6.内蒙古农业大学博士启动基金项目（BJ08-18）；7.国家自然科学基金项目（30840011）；8.内蒙古自然科学基金项目（200508010406）。共发表学术论文30余篇，其中以第一作者发表论文7 篇，以通信作者发表论文14 篇。申请发明专利2 项。“双歧杆菌V9的创新研究及产业化开发”项目获得内蒙古科学技术进步一等奖。编写教材包括：《乳品加工实验》、《农产品贮藏与物流学》、《发酵食品工艺学》、《功能性食品学》等。

编辑：阎一鸣、农梦琪；责任编辑：刘莉

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