《食品科学》：中南林业科技大学赵一凡助理研究员等：T-2毒素降解菌株的筛选、鉴定与降解机制分析

T-2毒素是由拟枝孢镰刀菌、枝孢镰刀菌、三线镰刀菌等真菌产生的有毒次生代谢物，属于毒性最强的A类单端孢霉烯族毒素，主要污染燕麦、小麦、大麦、玉米等谷物和动物饲料，随之进入食物链对人畜的健康造成巨大危害。目前，T-2毒素的脱毒方法主要有物理、化学和生物法。生物法包括利用微生物产酶（或代谢物）降解毒素和吸附毒素两种方式，具有绿色、安全、专一、高效等优点，是近年来真菌毒素脱毒研究的热点。微生物吸附具有可逆性会导致毒素分子重新释放，限制其实际应用；微生物产生的酶可将毒素降解为其他低毒或无毒的产物，应用前景广阔。现有研究主要集中于T-2毒素降解微生物的筛选、降解效果的表征以及降解产物的推导上，对降解机制的分析还有所欠缺，且菌株降解性能不稳定、易退化等问题限制了大规模应用，生物降解T-2毒素的菌种资源仍然较为匮乏。

中南林业科技大学食品科学与工程学院的马妍和国家粮食和物资储备局科学研究院的孙长坡，赵一凡*等从小麦样品中分离筛选对T-2毒素具有降解性能的微生物，并进行菌种鉴定与降解特性研究，利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）仪分析2 株菌单独和共同降解T-2毒素产生的代谢产物，从而分析其降解机制，以期降低谷物中T-2毒素的含量，为保障粮油食品和饲料质量安全奠定基础。

1 T-2毒素脱毒菌株筛选

从50 份小麦样品中筛选出30 份对T-2毒素具有脱毒效果的样品，分离纯化得到48 种单菌落，其中10 株菌对T-2毒素的脱除率大于90%，对其进行多轮复筛后，获得2 株脱毒效率高且稳定的菌株AFJ-2和AFJ-3，复筛结果如表1所示。

2 T-2毒素脱毒菌株鉴定

菌株AFJ-2和AFJ-3经16S rDNA初步鉴为短小杆菌属（

Curtobacterium

Bacillus

3 菌株AFJ-2和AFJ-3对T-2毒素的降解特性

3.1 脱毒曲线

以初始OD 600 nm =0.1将菌株AFJ-2和AFJ-3接种至含（无）T-2毒素的LB培养基中，观察2 株菌的生长状况、T-2毒素的脱毒过程以及T-2毒素对菌株生长的抑制效果。如图2所示，菌株AFJ-2和AFJ-3分别在2～12 h和6～14 h内呈对数生长，T-2毒素质量浓度随着菌体密度快速增加而迅速减少，分别在7 h和12 h将5 μg/mL T-2毒素完全消耗，因此2 株菌对T-2毒素的脱除效率较高，而在12 h和14 h菌株生长才进入稳定期，说明菌株优先利用T-2毒素作为碳源以供生长需要。AFJ-2的生长未受T-2毒素毒性作用的影响，但AFJ-3的生长受到明显抑制，故其脱毒效率低于AFJ-2。T-2毒素可通过抑制微生物细胞蛋白质、RNA和DNA的合成，从而影响菌体生长繁殖。

3.2 菌株AFJ-2和AFJ-3对T-2毒素的吸附作用

将2 株菌菌体的活细胞与灭活细胞与T-2毒素共培养，观察其对T-2毒素的降解与吸附能力。由图3可知，当菌株AFJ-2和AFJ-3的活细胞与T-2毒素反应时，T-2毒素质量浓度随着培养时间延长逐渐降低，分别在2 h和12 h内将T-2毒素从5 μg/mL降至0.16 μg/mL和0.11 μg/mL，而灭活细胞对T-2毒素不产生任何作用。因此2 株菌对T-2毒素的脱除均属于生物降解，且不存在吸附作用。

3.3 T-2毒素降解活性物质定位

为了进一步确定2 株菌降解T-2毒素的活性物质位于胞内或胞外，将胞外上清液和细胞内容物与T-2毒素反应2 h后检测T-2毒素含量，结果如图4所示，菌株AFJ-2和AFJ-3的胞外上清液对T-2毒素几乎不降解，而细胞内容物在2 h内分别使T-2毒素质量浓度从5 μg/mL减少至0.24 μg/mL和1.16 μg/mL，反应效率极高。因此，2 株菌降解T-2毒素的活性物质均位于胞内，并且很可能是一种或多种酶。

3.4 灭火与抑制剂对细胞内容物降解T-2毒素的影响

灭活、蛋白酶K、SDS和PMSF均能破坏蛋白质的结构使酶变性失活，通过上述处理后的细胞内容物与T-2毒素反应2 h后，测定其含量并计算降解率，结果如图5所示，2 株菌的细胞内容物对T-2毒素的降解均受到显著抑制（

P

4 T-2毒素降解产物分析

4.1 菌株AFJ-2降解T-2毒素产物分析

采用UPLC-Q-TOF-MS分析菌株AFJ-2降解T-2毒素的产物，总离子流图如图6A～D所示，T-2毒素（保留时间（retention time，

t

t

t

利用软件Mass Hunter搜索所有可能化合物，与软件PCDL中T-2毒素常见代谢产物数据库进行比对。产物a、b的匹配结果为HT-2（C22H32O8）、T-2三醇（C20H30O7），

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z

采用40 eV的碰撞能量，对产物a、b与HT-2、T-2三醇标准品溶液进行二级质谱分析，结果如图6E～H所示，二级质谱图中

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4.2 菌株AFJ-3降解T-2毒素产物分析

采用UPLC-Q-TOF-MS分析菌株AFJ-3降解T-2毒素的产物，如图7A～D所示，T-2毒素（

t

t

m

z

4.3 菌株AFJ-2和AFJ-3共同降解T-2毒素产物分析

菌株AFJ-2和AFJ-3粗酶液混合后与T-2毒素反应，利用Mass Hunter分析产物变化规律，通过

m

z

通过不同时间先后加入AFJ-2和AFJ-3粗酶液分析产物X。如图8B所示，在AFJ-2将T-2毒素完全降解的时间点（图中虚线处）加入AFJ-3的粗酶液，HT-2开始呈现下降趋势，也出现了产物X随时间缓慢大量增加，因此认为产物X是HT-2减少转化的产物。同理可得，如图8C所示，AFJ-3将T-2毒素完全降解时加入AFJ-2粗酶液，NEO开始减少，产物X缓慢大量增加，因此产物X也是NEO减少转化的产物。

根据上述实验结果推断，如图9所示，AFJ-2能够以AFJ-3降解T-2毒素产生的NEO为底物，使其脱去C-4乙酰基变成产物X；AFJ-3能够以AFJ-2降解T-2毒素产生的HT-2为底物，使其脱去C-8异戊酰基变成产物X；结合降解位点和化学结构推测产物X为4-脱乙酰-NEO。据文献报道，HT-2、T-2三醇和NEO的毒性均低于T-2毒素，毒性大小依次为T-2＞HT-2＞T-2三醇＞NEO。至今未有4-脱乙酰-NEO毒性作用的详细报道，根据其烷基侧链仅剩一个乙酰基团推测，4-脱乙酰-NEO的毒性低于上述3 种产物。

作为毒性最强的单端孢霉烯族毒素、T-2毒素可导致亚致死性或致死性中毒，严重威胁人类和动物的生命健康。相较于传统的物理、化学脱毒法，生物法具有高效、专一、安全的特点，筛选降解微生物是控制T-2毒素污染的一项有效措施。早在20世纪80年代，Ueno等从土壤中发现了短小杆菌114-2能将T-2毒素转化为HT-2和T-2三醇；本研究中菌株AFJ-2的降解途径与Uneo的研究结果一致，并进一步结合芽孢杆菌AFJ-3共同降解T-2毒素，获得了新的产物4-脱乙酰NEO，同时这也是首次明确芽孢杆菌属菌株降解T-2毒素的代谢产物。迄今为止，国内外报道了多种微生物能够降解T-2毒素，而AFJ-2和AFJ-3在降解性能方面表现出一定的优势：Hassan等在草莓酱中发现巨大芽孢杆菌344-1在44 h内仅去除78%的T-2毒素（0.6 μg/mL）；施琦从自然环境中筛选的弯曲假单胞菌和尼泊尔葡萄球菌，72 h对5 ng/mL T-2毒素的降解率分别为90.9%和85.5%；黑曲霉7 d内对5 μg/mL T-2毒素的降解率仅为69.8%。本研究中AFJ-2和AFJ-3分别在7 h和12 h内能够去除99.9%的T-2毒素（5 μg/mL），降解效率均高于上述菌株，具有很大的应用潜力。

降解产物的安全性是决定降解菌株实际应用价值的重要指标之一。本研究中降解产物HT-2、T-2三醇、NEO和4-脱乙酰NEO均由T-2毒素水解侧链烷基酯键产生，而侧链烷基的数量与位置与T-2毒素的毒性息息相关。C-4位取代基可抑制多肽链的延伸和终止，研究表明，T-2毒素会优先脱去C-4乙酰基产生HT-2，但HT-2与T-2毒素毒性相差不大；当C-15和C-4位均存在较大基团时，会抑制蛋白质合成的起始阶段，且C-4至C-15之间的大环（烃链）本身也具有毒性作用，因此T-2毒素转化为T-2三醇后毒性降低99.64%；C-8位异戊酰基的亲脂性使T-2毒素更易渗透到生物体，当C-8异戊酰基被取代生成NEO时，对小鼠淋巴瘤细胞的毒性显著降低了91%。由上述研究可知，本研究中代谢产物的毒性均低于T-2毒素。通过降解位点推测出共代谢产物4-脱乙酰-NEO，由于目前市场上无标准品出售，未能通过二级质谱分析对它进行鉴定，根据侧链基团缺失的数量与位置推测其毒性低于另外3 种产物，但它的毒性机制尚不清晰。

多项研究表明，T-2毒素的水解过程主要由羧酸酯酶参与。大鼠肝微粒体中T-2毒素被代谢为HT-2，由特定酶抑制剂鉴定出是丝氨酸羧基酯酶的作用，这与本研究中利用抑制剂PMSF得出T-2毒素降解酶中含有丝氨酸基团的结论一致；Johnsen和Lin Nini等同样采用酶抑制剂的方法，证明了人类血细胞和肝微粒体中的羧酸酯酶对T-2毒素具有水解作用；Lattanzio等从玉米中纯化出具有酯酶活性的蛋白部分，该蛋白提取物能在90 min内将5 μg T-2毒素完全转化为HT-2。酶法降解真菌毒素具有显著的优势，但T-2毒素降解酶的鉴定至今未取得突破。根据本研究中的产物类型可知，菌株AFJ-2和AFJ-3产生的T-2毒素降解酶属于羧酸酯酶类，后续可借助分子生物学、蛋白质组学等手段，对该降解酶进行分离纯化。

本研究从小麦样品中分离获得2 株T-2毒素高效降解菌株AFJ-2和AFJ-3，由16S rDNA初步鉴定为短小杆菌属和芽孢杆菌属菌株。AFJ-2和AFJ-3分别能在7 h和12 h内将5 μg/mL T-2毒素完全降解；明确了2 株菌对T-2毒素的降解来源于细胞内产生的酶，不存在吸附作用；灭活与抑制剂（蛋白酶K、SDS和PMSF）处理会显著抑制胞内酶对T-2毒素的降解效果。菌株AFJ-2和AFJ-3分别将T-2毒素降解为低毒产物HT-2、T-2三醇和NEO，推测它们共同降解T-2毒素能产生新的产物4-脱乙酰-NEO，且AFJ-3能以HT-2为底物（AFJ-2能以NEO为底物）生成4-脱乙酰-NEO。本研究获得的微生物资源对T-2毒素的污染防控与酶制剂的开发应用具有重要意义。

本文《 T-2 毒素降解菌株的筛选、鉴定与降解机制分析 》来源于《食品科 学》2023年44卷第22期 173 -1 82 页，作者：马 妍 ，孙长坡 ，王 峻 ，杜 稳 ，刘虎军 ，周文化 ，赵一凡 。 DOI: 10.7506 / spkx1002-6630-20221111-126 。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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