近年来，食物过敏性疾病在世界范围内的发生率呈现上升趋势，已经成为一个公众性、全球性的健康问题。松仁属于八大类食物过敏原中的坚果类，坚果是致命性过敏反应的最常见原因之一。由于现阶段对于松仁过敏尚无有效治疗手段，过敏人群只能依赖食品标签识别避免日常饮食中出现松仁。在食品生产过程中，含松仁的食品与其他食品共用生产线，可能导致交叉污染，此类隐性过敏原是导致过敏的主要原因。质谱技术具有高通量、高分辨率、高灵敏度等优点，不仅可以避免加工过程中蛋白质变性而引起的假阳性结果，而且可以避免同源性蛋白质导致的假阳性问题，在食品中过敏原的定量检测方面具有较高的优势。
河北科技大学食品与生物学院的宁亚维、周泓鑫和河北省食品检验研究院的李强*等拟筛选松仁特异性肽段，建立一种UPLC-MS/MS对常见食品基质中的松仁过敏原Pin k 2进行快速检测，以期对食品中松仁过敏原进行高灵敏度检测，为我国食品标签真实性检验及食品中松仁隐性过敏原的检测提供技术支持。
1 特征肽段的筛选
特征肽段对液相色谱-质谱检测方法的特异性和灵敏度具有重要影响。将经过酶解净化后的样品使用Easy-nLC 1000-Q-Exactive LCQ液相色谱-串联高分辨质谱仪进行分离分析，随后结合Uniprot蛋白数据库以及ProteinPilotTM软件对得到的质谱谱图进行数据处理，得到大量的肽段信息（图1）。然后按照以下的肽段筛选原则进行特征肽段的筛选：首先是对肽段长度的要求，应为8～25 个氨基酸为宜，肽段过短难以满足特异性要求，过长则容易在前处理过程中断裂；其次，所选肽段不应含修饰位点，也不应漏切和错切的酶切位点，以保证方法的可重复性；经BLAST搜索后具有特异性，以免在其他物种中被检测到，出现假阳性结果；在进行定性和定量分析时，具有较高的灵敏度和良好的峰形。根据以上筛选原则，最终筛选了3条符合条件的松仁特异性肽段，分别为ALPNFGEVSELLEGISR、LEILWFDINTSGNER、NNVLQTLEK。其中NNVLQTLEK肽段为本实验中首次筛选到的特异性肽段。松仁过敏原与花生过敏原Ara h 3有重合的线性表位，为了保证所筛选的肽段具有特异性，制备了花生、杏仁、核桃、芝麻、葵花籽、开心果和榛子等常见坚果的酶解样品验证松仁肽段特异性，结果显示，所筛选的3 条松仁肽段均只在松仁酶解样品中检测到，而其他坚果酶解样品均显示未检出。说明所筛选肽段具有高度特异性，可用于松仁过敏原检测方法的开发。
2 流动相及质谱参数的优化
在相同的梯度洗脱程序条件下，对比100%水、0.1%甲酸-水和100%乙腈、0.1%甲酸-乙腈分别作为流动相A和流动相B时特征肽段的响应值和峰形。结果表明，以0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈分别作为流动相A和流动相B，特征肽段的响应值和峰形都更好，明显改善了拖尾现象，且肽段的稳定性较高。加入甲酸可以在一定程度上促进肽类物质的电离，从而增强其质谱信号，因此后续研究采用0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-乙腈分别作为流动相A和流动相B。
通过ProteinPilotTM得到的数据信息中可以得到特异性肽段的母离子和b、y离子参数，选取响应值较高的b、y离子作为子离子。制备高浓度的松仁酶解样品，通过蠕动泵以5 μL/min的速率直接注入Qtrap 5500质谱仪中，以全扫描模式依次确定肽段的精确母离子、子离子以及其他质谱参数，为保证检测结果的准确度，每个肽段选取3 个子离子。优化后的去簇电压、碰撞能量参数见表1，优化后的色谱图见图2。
3 方法学验证结果
3.1 线性关系、检出限、定量限
通过对方法线性关系、检出限和定量限的测定考察方法的灵敏度和适用的浓度范围。3 条特征肽段的线性关系、检出限和定量限结果见表2。3 条特征肽段在饼干、巧克力和饮料3 种基质中的线性良好，R2均能达到0.99以上。其中NNVLQTLEK在3 条特征肽段中灵敏度最高且稳定性好，故选取NNVLQTLEK作为松仁定量分析肽段，其他两条肽段作为辅助定性肽段。在饼干和巧克力这两种固体基质中，检出限、定量限分别为1 mg/kg和2.5 mg/kg；在饮料基质中，检出限、定量限分别为0.005 mg/mL和0.01 mg/mL。目前对于松仁过敏原检测的研究报道较少，Lee等以ALPNFGEVSELLEGISR为定量肽段建立的LC-MS/MS法检测饼干中的坚果过敏原，其中松仁过敏原检出限为10 mg/kg。而本研究中筛选到的NNVLQTLEK肽段，检出限（1 mg/kg）仅为该方法的十分之一，表明本方法可实现松仁过敏原的高灵敏度检测。
3.2 加标回收实验结果
为考察方法的重复性和稳定性，在空白基质中添加松仁标准储备液进行加标回收率和精密度的测定。松仁在饼干、巧克力和饮料3 种空白基质中的加标回收率如表3、4所示，在饼干基质中的回收率在88.50%～107.57%之间，相对标准偏差（RSD）为0.94%～4.21%；在巧克力基质中的回收率在96.60%～104.57%之间，RSD为2.22%～6.08%；在饮料基质中的回收率在87.42%～108.20%之间，RSD在1.79%～4.89%之间。上述结果表明，此方法具有较好的准确度且重复性好。
3.3 基质效应
食品基质会在一定程度上对目标化合物起到促进或抑制作用，为验证食品基质是否对检测方法有干扰，对定量肽段NNVLQTLEK的基质效应进行检测。定量肽段NNVLQTLEK的基质效应如图3所示，结果表明饼干的基质效应为89.77%，巧克力的基质效应为91.82%，饮料的基质效应为96.13%，结果均小于100%，说明饼干、巧克力、饮料对特征肽段均有不同程度的抑制作用，因此，后续研究均采用基质配标定量以补偿基质效应。
水：Y＝5.28510×105X+4.14375×104（R2＝0.9850）；饼干：Y＝4.74455×105X+3.94923×104（R2＝0.9829）；巧克力：Y＝4.85286×105X+3.40184×104（R2＝0.9893）；饮料：Y＝5.08075×105X+5.35166×104（R2＝0.9841）。
4 实际样品检测结果
为了检验方法的适用性，自当地市场随机购买了饮料、饼干和巧克力等样品，利用所建立方法对其中的松仁含量进行定量，检测结果如表5 所示。10 个饼干样品中，有3 个样品（分别为饼干-7、饼干-8以及饼干-9样品）明确标注含有松仁成分，检测结果显示样品中均检出松仁成分，含量范围为（0.088±0.005）～（97.972±0.455）g/kg。其余7 个饼干样品、6 个饮料样品和6 个巧克力样品对于过敏原信息的标注均为“可能含有坚果”，但并未写明具体所含坚果的种类，检测结果显示均未检测出松仁。上述结果表明此方法可以应用于食品标签准确性的验证，同时可以筛查未明确标注松仁过敏原的食品中是否含有松仁成分。
5 结论
本研究开发了一种UPLC-MS/MS检测食品中松仁过敏原Pin k 2的方法。通过蛋白质组学与高分辨质谱结合成功筛选到3 条松仁特征肽段，进一步采用三重四极杆质谱的多反应监测模式建立了食品松仁过敏原快速检测方法。该方法具有灵敏度高、特异性好等优势，可为我国食品标签真实性检验及食品中隐性过敏原的检测提供技术支持。
本文《UPLC-MS/MS法检测3 种食品中松仁过敏原》来源于《食品科学》2024年45卷1期247-253页. 作者：宁亚维，周泓鑫，杨正，马俊美，刘茁，张岩，李强. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230118-140. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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