中山大学的毛洋研究团队2024年在期刊Nat Commun.上发表了题为“Sequential glycosylations at the multibasic cleavage site of SARS-CoV-2 spike protein regulate viral activity”的研究论文。

Abstract

刺突蛋白 S1/S2 上的多碱基弗林蛋白酶切割位点是 SARS-CoV-2 的标志，在病毒感染中起着至关重要的作用。然而，弗林蛋白酶激活及其调控的机制仍不清楚。在这里，我们发现 GalNAc-T3 和 T7 共同启动 SARS-CoV-2 刺突蛋白弗林蛋白酶切割位点的聚集 O-糖基化，从而抑制弗林蛋白酶加工，抑制刺突蛋白掺入病毒样颗粒并影响病毒感染。机制分析表明，刺突蛋白组装成病毒样颗粒依赖于弗林蛋白酶切割的刺突蛋白与 SARS-CoV-2 膜蛋白之间的相互作用，这表明弗林蛋白酶激活的可能机制。有趣的是，病毒 alpha 和 delta 变体的刺突蛋白突变赋予了对 GalNAc-T3 和 T7 糖基化的抗性。在 omicron 变体中，额外的突变会逆转这种抗性，使刺突蛋白在体外易受糖基化，并对人肺细胞中的 GalNAc-T3 和 T7 表达敏感。作者的研究结果强调了糖基化作为宿主细胞对抗 SARS-CoV-2 的一种防御机制的作用，并揭示了宿主和病毒之间的进化相互作用。

Results

GalNAc-T3和 T7 启动聚集的 O-糖基化，覆盖 SARS-CoV-2 S 蛋白中的多碱基裂解位点

先前的研究已使用来自各种来源的蛋白质在 SARS-CoV-2 刺突蛋白的多碱基弗林蛋白酶位点附近鉴定了几个 O-糖基化位点，在这些位点中，T676 和 T678 被鉴定得最多。弗林蛋白酶在此将 S 蛋白裂解为 S1 和 S2 亚基2，作者采用了 SimpleCell，将复杂的 O-糖结构简化为单个 GalNAc 残基，以便通过 Vicia villosa 凝集素 (VVA) 有效富集，并通过质谱法更容易鉴定。

为了研究刺突蛋白弗林蛋白酶切割位点附近的 O-糖基化的功能及其在病毒感染中的生物学相关性，最初的目标是确定负责这些修饰的特定 GalNAc-T。哺乳动物 GalNAc-T 同工酶共有 20 种，分为几个亚家族，因此我们研究了不同亚家族的代表性 GlaNac-Ts，包括 GalNAc-T1、T2、T3、T4、T5、T7、T11 和 T18，对包含武汉原始毒株（Wuhan-Hu-1）S 蛋白多碱基裂解位点序列的合成肽的体外活性。在所有测试的 GalNAc-Ts 中，作者发现 GalNAc-T3 对合成的多碱基底物表现出最显著的活性，在测试条件下将单个 GalNAc 添加到肽中，转化率几乎为 100%。使用基于 ETD 的 LC-MS 分析，作者确定 GalNAc-T3 特异性地修饰了对应于刺突蛋白 T678 的残基。与之前的研究一致，结果表明，GalNAc-T1（一种“管家”GalNAc 转移酶）也可以在体外修饰含弗林蛋白酶位点的肽。

除GalNAc-20外，所有的GalNAc-Ts 都具有独特的凝集素结构域和催化结构域。因此，作者研究了哪些 GalNAc-T 可能与 GalNAc-T3 修饰肽相互作用，从而在弗林蛋白酶位点附近产生额外的糖基化。在所有测试的 GalNAc-Ts 中，只有 GalNAc-T7 很容易地将先前糖基化的刺突肽作为其底物，我们发现 GalNAc-T7 主要修饰了刺突蛋白的 S686 对应的残基，对 S689 对应的残基的活性较小。

总的来讲，GalNAc-T3 和 T7 的活性可能是在重组刺突蛋白上鉴定出的 O-糖基化位点的原因，这些位点是 T678、S686 和 S689。

GalNAc-T3和 T7 抑制刺突蛋白的弗林蛋白酶加工

为了测试 GalNAc-T3 和 T7 引发的 O-糖基化是否可以抑制细胞中 S 蛋白多碱基裂解位点的蛋白酶加工。首先构建了一个基于荧光素酶的生物传感器，该传感器编码夹在 Gaussia 荧光素酶和膜锚定 eGFP 之间的 S1/S2 边界序列。HEK293T 中的弗林蛋白酶对多碱基序列的裂解会将荧光素酶释放到培养基中，而膜结合的 eGFP 可使发光信号因转染和表达水平的变化而正常化，所构建的生物传感器可以作为含有 Spike 多碱基切割位点的序列中蛋白酶加工活性的有效报告子。

生物传感器与GalNAc-T3和T7的共表达导致培养基中荧光素酶信号减少78%，而单独使用GalNAc-T3或T7观察到的抑制并不显著。尽管GalNAc-T3和T7在HEK293T中内源性表达，但它们的水平可能不足以使过表达的底物完全糖基化。结合体外酶促实验，生物传感器实验结果表明，GalNAc-T3和T7在 SARS-CoV-2 S 蛋白多碱基裂解位点的顺序糖基化可以抑制细胞中furin的裂解。

为了确定这些发现是否可以扩展到全长刺突蛋白，并将其与糖基化位点的单突变或双突变进行了比较。令我们惊讶的是，T678A或S686A的单突变并没有显著影响过表达刺突蛋白S2片段的产生。然而，双突变似乎导致S2产量略有增加。单独敲入GALNT7导致穗蛋白加工产生的S2减少约20%，并且，当GALNT3和GALNT7同时被敲入时，从过表达的刺突蛋白中产生的S2片段被抑制了40%以上。这表明t7催化的糖基化可能是多糖基化事件中的限速步骤，该步骤的产物传递了蛋白酶加工的保护功能。正如预期的那样，刺突蛋白与GalNAcT3和T7的共表达显著抑制合胞体的形成，显示出类似于furin位点(R685A突变)的表型。

结果表明，GalNAc-T3和T7协同促进刺突蛋白多碱基切割位点附近的串联糖基化，T7在S686位点的糖基化在阻止HEK293T细胞蛋白酶加工蛋白质和抑制其融合活性方面起着关键作用。

GalNAc-T3和 T7 抑制弗林蛋白酶依赖性的病毒样颗粒 (VLP) 组装

由于参与o -糖基化途径的大多数酶位于高尔基体中，冠状病毒在高尔基体中间室(ERGIC)中组装。作者对T3和T7糖基化活性对组装病毒粒子中刺突蛋白的furin切割的潜在影响感到好奇。因此，尝试在具有或不具有GALNT3/GALNT7 KI的HEK293T细胞中组装SARS-CoV-2的病毒样颗粒(VLPs)。利用VLPs能够研究GalNAc-T3和T7介导的furin位点O糖基化对刺突蛋白组装成病毒粒子的影响。

GALNT3和GALNT7的双KI导致包装在VLP颗粒中的刺状蛋白的数量减少了大约80%，尽管刺状蛋白在总细胞溶解物中的表达水平没有明显变化。将T678A/S686A突变体掺入VLPs后，不再受GalNAc-T3和T7过表达的影响，这证实GalNAc-T3和T7可能通过T678和S686的糖基化抑制刺突蛋白并入VLP。

我们研究了刺突蛋白在SARSCoV-2病毒粒子中依赖于furin蛋白切割的组装的可能机制。据报道，furin切割从多碱基切割位点释放多个精氨酸残基(RRAR)，而触发与宿主细胞受体neurophilin-1的相互作用。SARS-CoV S蛋白和M蛋白之间的相互作用是病毒组装所必需的。于是假设在SARS-CoV-2的情况下，furin切割的多碱基S1末端序列可能参与了与M蛋白的相互作用。作者注意到，SARS-CoV-2蛋白的N端胞外结构域包含一个EE基元(图3d)，它可能潜在地介导与断裂的S1片段的电荷相互作用。因此，将丙氨酸突变引入M蛋白的EE基序，发现M蛋白的EE突变体无法将刺突蛋白整合到VLP中。反映了刺突蛋白的R685A突变体与完整的M蛋白产生的表型。所以，M蛋白的EE基序对于S蛋白组装到VLP中是必不可少的，可能是通过与裂解S的电荷-电荷相互作用来实现的。

为了证实糖基化在刺突蛋白依赖的激活中所起的作用，对从vlp产生细胞中分离的刺突蛋白进行了糖分析。与我们获得的过表达刺突蛋白的结果相似，我们能够在furin切割位点周围的肽上识别多个糖基化，包括S686上的糖基化。Furin的裂解不仅激活了S蛋白，而且促进了S蛋白与病毒粒子的结合。

多碱基裂解位点附近的突变会改变GalNAc-T3 和 T7 的糖基化效率

五种 WHO 确认的受关注变异株 (VOC) 中，有三种在脯氨酸 681 (P681) 处发生突变，该位置距糖基化位点 T678 有三个氨基酸。其中，alpha 和 omicron 变异株在此位置有一个组氨酸 (P681H)，而 delta 变异株在此位置有一个精氨酸 (P681R)。此外，omicron 变异株在 O-糖基化位点 T678 旁边携带 N679K 突变。为了研究这种糖基化调节机制的演变是否适用于 SARS-CoV-2 变体的刺突蛋白

由于序列非常接近，推测 P681 突变可能影响 GalNAc-T3 和 T7 在体外对 S 蛋白的酶活性。将合成肽底物中的 P681 残基与组氨酸 (P681H) 交换时，与武汉-Hu-1 株序列的原始肽相比，GalNAc-T3 和 T7 无法有效地对肽进行糖基化，产生的糖基化产物很少。当 P681H 突变与 Omicron 中发生的 N679K 突变叠加时，惊讶地发现 GalNAc-T3 和 T7 在酶促测定中对合成肽恢复了显著活性，产生了单和双 GalNAc 化产物。这个结果很有趣，因为结合关于 GalNAc-T3 和 T7 在多碱基序列上的糖基化及其对武汉-Hu-1 毒株刺突蛋白弗林蛋白酶加工的抑制的发现，这表明目前占主导地位的 Omicron 变体（以 P681H 和 N679K 突变为特征）可能对宿主细胞糖基化表现出敏感性。以前的变体可能成功避免了这种相同的调节机制。

数据表明，SARS-CoV-2 变体在多碱基裂解位点附近携带的突变对 GalNAc-T3 和 T7 的糖基化效率有显著影响。SARSCoV-2 早期变体（α 和 δ）携带的 P681 处的单一突变可能使病毒能够抵抗宿主细胞糖基化，但在最新的 omicron 变体中引入额外的 N679K 突变可能会使病毒再次容易受到宿主细胞糖基化调节。

GalNAc-T3和 T7 的过度表达抑制了人类肺细胞中的 omicron

为了研究这种糖基化调节机制的演变是否适用于 SARS-CoV-2 变体的刺突蛋白（这些蛋白包含除 P681 和 N679 之外的其他突变）。

使用武汉-Hu-1、α 和 omicron 变体的刺突蛋白分析了 S 蛋白掺入 VLP 的情况。与上一节中展示的类似，GALNT3 和 GALNT7 的双重 KI 显着减少了武汉-Hu-1 掺入 VLP 病毒体的刺突蛋白量。同样，两种 GalNAc-T 的过表达也导致 omicron S 蛋白掺入 VLP 的量显着减少。对于 alpha S 蛋白，观察到的减少程度要小得多。这些发现与我们的观察结果一致，即 alpha S 蛋白中存在的 P681H 突变赋予了对弗林位点糖基化的抗性。相反，omicron 变体逆转了这种现象。

由于 SARS-CoV-2 的 omicron 变体已成为全球主要毒株之一。决定研究 SARS-CoV-2 的 omicron 变体对 GalNAc-T3 和 GalNAc-T7 在人肺细胞中产生的抑制的敏感性。用早期 omicron 亚变体 BA.1、原始武汉-Hu1 和 alpha 亚变体 B1.1.7 感染了人肺细胞系 Calu-3 细胞，并在单独或组合过表达或不过表达 GalNAc-T3 和 T7 的情况下测量了病毒滴度。如图 5b 所示，在感染复数 (MOI) 为 0.1 的情况下，在最初 24 小时内，omicron 亚变体 BA.1 的复制被 GalNAc-T3 和 T7 的共表达显著抑制。感染后 48 小时 (h.p.i.)，与 WT)相比，过表达 GalNAc-T3 和 T7 的 Calu-3 细胞中 omicron 病毒的病毒滴度降低了约 76%。值得注意的是，单独表达 GalNAc-T7 也表现出类似程度的病毒滴度降低。这一发现与 GalNAc-T7 在抑制刺突蛋白组装成病毒样颗粒 (VLP) 方面的重要作用相一致 。

为了研究 GalNAc-T3 和 T7 对病毒感染过程中 S 蛋白加工和随后的病毒体组装的抑制作用，收集了 omicron 病毒体的沉淀物，并通过蛋白质印迹分析了 S 和 N 蛋白的水平，我们观察到 GalNAc-T3 和 T7 的共同过表达和 GalNAc-T7 的单独过表达都导致 Omicron 病毒体中掺入的 S 蛋白量显著减少。GalNAc-T3 和 T7 感染 omicron 病毒可能是通过刺突蛋白的弗林蛋白酶加工位点的糖基化实现的。

令人惊讶的是，原始武汉-Hu-1 病毒的复制似乎受 GalNAc-T3 和 T7 过度表达的影响较小，而含有 P681H 突变的 alpha 变体 (B1.1.7) 的复制受 GalNAc-T3 和 T7 的抑制程度与 omicron 变体相当 。很明显，GalNAc-T3 和 T7 介导的糖基化在病毒感染的调节中起着重要作用，目前流行的 SARS-CoV-2 变体 Omicron 仍然对这种调节有反应。刺突蛋白多碱基位点的糖基化可用于未来的治疗干预。

discussion

作者证明了两种 GalNAc 转移酶 GalNAc-T3 和 T7 协同作用，在 SARSCoV-2 刺突蛋白的多碱基裂解位点附近形成聚集的 O-糖基化。发现 GalNAc-T3 和 T7 的共同表达足以抑制刺突蛋白组装成 VLP，类似于消除弗林蛋白酶切割位点。我们的发现为宿主细胞糖基化调控病毒感染提供了一种合理的机制，并为开发针对 SARS-CoV-2 的潜在治疗干预策略奠定了理论基础。

原文链接：://www.nature.com/articles/s41467-024-48503-x

来源：ZhaoSunLab

编辑：吃一口小猫